Recherche des facteurs biochimiques explicatifs des variations de dégradabilité de parois, dans un contexte de teneur en lignine fixée, et impacts sur les performances agronomiques chez le maïs

Polymères et assemblages moléculaires de la paroi végétale

La paroi cellulaire s’organise en trois couches , la lamelle moyenne riche en pectine mature assurant la cohésion des cellules, la paroi primaire qui contient une quantité similaire de cellulose, hémicellulose et pectine, et la paroi primaire se retrouve seulement dans les cellules méristématiques car elle est élastique et permet l’élongation. La paroi secondaire est beaucoup plus épaisse que la primaire, elle peut être subdivisée en trois sous-couches : S1, S2 et S3 , qui se différencient par l’orientation de leurs microfibrilles de cellulose (Taylor, 2008). La paroi secondaire se met en place suite à l’arrêt de la croissance de la paroi primaire qui se fait par des dépôts successifs de cellulose cristallisée et de lignines. Ces deux composantes sont responsables de la rigidité de la paroi cellulaire. Ces régions pariétales présentent des compositions chimiques distinctes. Les polymères constitutifs des parois végétales se regroupent en deux grandes catégories : les polysaccharides tels que la cellulose, les hémicelluloses, les pectines et les composés phénoliques comme la lignine et les acide p-hydroxycinnamiques.

Mise en place de la lignification au cours du développement

Après l’échelle de la molécule, des polymères et des assemblages moléculaires évoqués dans les paragraphes précédents nous voici transportés dans un monde à deux échelles : celle de la plante et de sa tige et celle de la cellule.

Mise en place des parois au cours du développement cellulaire

La constitution de la paroi cellulaire est variable avec l’âge de la cellule. Cette paroi évolue au cours du développement, passant ainsi d’une paroi primaire non lignifiée à une paroi qui s’épaissit et se secondarise en se lignifiant de plus en plus. Ainsi au cours du développement, la composition de la paroi se modifie, ainsi que la structure et les teneurs en ses différents constituants. La compréhension des mécanismes de formation de la paroi constitue des enjeux scientifiques et économiques majeurs surtout dans l’optique de l’utilisation de la biomasse végétale pour les fourrages et les biocarburants.
L’évolution au cours du développement de la composition des parois peut être abordée en étudiant des plantes prélevées à différents stades de développement (Boon et al., 2005; Jung and Casler, 2006a; Boon et al., 2008; Boon et al., 2012) ou bien encore les entre nœuds d’une même plante (les entre nœuds du haut étant les moins matures) prélevés à différents niveaux (Chabbert et al., 1994a, b).

Mise en place des tissus lignifiés au cours du développement d’un entre nœud de maïs

Au cours de la division cellulaire, les nouvelles cellules d’un entre nœud sont produites par le méristème situé à la base de l’entre nœud. Il se met ainsi en place un gradient d’âge cellulaire, avec les cellules les plus âgées en haut de l’entre nœud. Ce gradient spatio-temporel se retrouve également en termes de lignification au sein de l’entre nœud. Le méristème reste actif jusqu’à la fin de l’élongation de l’entre nœud. Le système vasculaire chez les monocotylédones est généralement constitué de vaisseaux dispersés au sein de la tige et pas répartis sur une seule rangée comme chez les dicotylédones. Un entre nœud jeune de maïs est constitué du bord vers le centre de la tige, d’une couche épidermale, d’une zone corticale constitué de 6 à 8 couches, d’une large zone avec de nombreux vaisseaux vasculaires et de la moelle avec des vaisseaux plus éparses.
Les vaisseaux situés dans le cortex présentent un sclérenchyme important contrairement à ceux situés dans la moelle . Au stade jeune, comme le montrent Jung et Casler (2006a) chez le maïs en différenciant l’avancement de la lignification dans le cortex  et dans la moelle seul le protoxylème des vaisseaux est lignifié.  Ensuite, le protoxylème reste le seul tissu lignifié mais les cellules du sclérenchyme qui entourent les vaisseaux du cortex commencent à s’épaissir . Avec la fin de l’élongation de l’entre nœud à la date 6 de prélèvement, Jung et Casler (2006a) montrent que le métaxylème et le sclérenchyme associé aux vaisseaux ont commencé à se lignifier. A la date 8 de prélèvement, le parenchyme cortical a développé des parois épaisses et lignifiées et quelques spots de sclérenchyme non associés à des vaisseaux sont lignifiés . Dès le stade floraison, le pattern de lignification est donc déjà bien marqué (Wong Quai Lam Nöel, 2011). L’équipe de H.J. Jung a beaucoup étudié la mise en place de la lignification des entre nœuds au cours du développement en relation avec l’évolution de la dégradabilité chez différentes espèces dont le maïs. Ils montrent que les sucres pariétaux sont en place dès le 4ème stade de prélèvement alors que la teneur en paroi et en lignines augmentent jusqu’au 7ème stade de prélèvement auquel l’élongation de l’entre nœud se termine .

Impact de la composition monomérique et de la structure des lignines sur la dégradabilité des parois

Les lignines de gymnospermes, entre autres différences avec celles d’angiospermes (Achyuthan et al., 2010), sont principalement composées de sous unités G et présentent une structure très condensée du fait de cette richesse. Une conséquence directe de cette composition/structure des lignines est que les arbres gymnospermes se prêtent moins bien aux traitements papetiers que les arbres angiospermes lors de la préparation de la pâte à papier (Whetten and Sederoff, 1991). Chez les arbres angiospermes, les modifications génétiques permettant une augmentation du rapport S/G aboutissant à des propriétés papetières améliorées (Boerjan et al., 2003). Des travaux récents sur la production de biocarburants à partir de bois ont montré que durant le prétraitement, les lignines de type syringyle sont plus facile à solubiliser (Li et al., 2010; Santos et al., 2010). Ainsi, un rapport S/G élevé est associé à un taux de récupération des sucres plus élevé (Santos et al., 2012). Une étude sur la modification structurale des lignocelluloses causée par les termites (Ke et al., 2011) a montré que les termites sont efficaces pour hydrolyser la cellulose et les hémicelluloses au sein de la matrice pariétale complexe. Dans les fèces de termites, les auteurs retrouvent des assemblages macromoléculaires issus des lignines qui ont subi des modifications structurales mais qui cependant ont conservé leurs abondantes liaisons β-O-4 entre sous unités des lignines. Dans de nombreuses espèces fourragères la teneur en lignines comme le rapport S/G augmentent avec la maturité des tiges (Jung and Vogel, 1986; Buxton and Russell, 1988). Ces facteurs se trouvent en outre négativement corrélés avec la dégradabilité (Buxton and Russell, 1988; Grabber et al., 1992; Sewalt et al., 1996; Jung et al., 1997). En 2010, Taboada et al. (2010) ont étudié plus d’une centaine d’échantillons d’ensilage (Lolium multiflorum et Trifolium) et ont montré que la dégradabilité était le plus limité par les sous unités S d’une part et les acides p-hydroxycinnamiques éthérifiés d’autre part.

Impact des différents tissus d’une tige sur la dégradabilité des parois

Bien qu’il existe de nombreuses données dans la littérature sur les relations entre la composition biochimique de la paroi cellulaire et la dégradabilité de la plante, ces informations ne permettent pas de rendre compte de l’intégralité des variations de dégradabilité de paroi observées. La structure des tiges et les proportions des différents tissus peuvent jouer un rôle dans l’explication de ces variations de dégradabilité.
Ainsi la variabilité dans le développement de la paroi cellulaire des tissus et les proportions relatives des différents types de tissus pourraient conduire à de fortes différences de dégradabilité de la plante. Il a été suggéré qu’au sein de la plante, la structure anatomique pourrait être plus importante que les facteurs biochimiques pour expliquer le taux et l’étendue de la dégradabilité (Wilson and Hatfield, 1997; Barros-Rios et al., 2012). Chez la luzerne, les variations de dégradabilité ont été reliées en partie aux variations de proportion des tissus (Jung and Engels, 2002; Guines et al., 2003). Une comparaison anatomique des tiges de switchgrass de plantes sélectionnées pour des dégradabilités contrastées a mis en évidence d’importants changements dans la distribution des tissus lignifiés (Sarath et al., 2005). Les génotypes de switchgrass qui présentaient les digestibilités les plus réduites étaient également ceux qui affichaient une lignification complète du parenchyme et du sclérenchyme cortical.
Une analyse de ces plantes a également montré une différence d’accessibilité aux cellulases. Ces travaux indiquent clairement que des différences dans l’architecture de la paroi cellulaire existent et que ces différences en plus des variations dans la composition pariétale impactent la dégradabilité des parois (Sarath et al., 2008). De la même façon, les lignées brown-midrib de maïs connues pour leur bonne dégradabilité présentent aussi une plus grande proportion de tissus non lignifiées (Ehlke and Casler, 1985). Chez le maïs toujours, mais au sein de la variabilité naturelle, il a été montré que les différents tissus rencontrés au sein d’une tige, leur répartition et leurs proportions au sein de cette tige ainsi que leur lignification peuvent aussi rendre compte d’une part importante des variations de dégradabilité de paroi (Méchin et al., 2005 ; Jung and Casler, 2006b).
Jung et Casler (2006b) ont étudié en détail la dégradation enzymatique de la région corticale de tiges d’hybrides de maïs au cours du développement. Ainsi sur des entre nœuds encore jeunes, après 24h d’attaque enzymatique par les microorganismes du rumen la majorité des tissus de la coupe sont reconnaissables mais tous, excepté le protoxylème des vaisseaux (qui est le premier à se lignifier au cours du développement), présentent des signes de dégradation importante .

Impact sur la dégradabilité des parois d’une spécificité forte des parois de graminées : la présence d’acides p-hydroxycinnamiques

Une étude utilisant de la cellulose isolée et un polymère modèle pour les lignines (polyeugenol) a indiqué que la digestibilité de la cellulose est réduite uniquement lorsqu’il y a réticulation chimique à la lignine (Gressel et al., 1983). Un peu plus tard, il a été proposé que la réticulation de la lignine et des arabinoxylanes via FA limite aussi la digestibilité des parois cellulaires en limitant l’accès physique des enzymes microbiennes hydrolytiques aux polysaccharides (Jung and Shalitajones, 1990; Jung and Deetz, 1993).
En 1972, Hartley (1972) rapportait une corrélation négative entre la dégradabilité des parois de ray-grass anglais (Lolium perenne L.) et le rapport de p-coumarate/férulate esters. Depuis, des études plus approfondies ont démontré que la réticulation des lignines et des arabinoxylanes via FA est responsable d’une partie de la limitation de la dégradabilité chez les graminées (Argillier and Barriere, 1996; Grabber et al., 1998b).
Dans des études de modélisation in vitro de la lignification, l’équipe de Grabber a mimé les réticulations par FA dans la paroi cellulaire de maïs. Leurs analyses de corrélation ont montré que la dégradabilité in vitro (avec utilisation de jus de rumen) est négativement affectée par l’augmentation de la réticulation par FA (Grabber et al., 1998b). Dans une étude dédiée à plusieurs graminées vivaces, le même type de résultats a été mis en avant par Casler et ses collaborateurs (Casler and Jung, 1999, 2006; Casler et al., 2008). Ils ont montré que la dégradabilité in vitro (avec utilisation de jus de rumen) était plus élevée pour les plantes dont les parois présentent des niveaux bas de réticulation par FA. Ils ont estimé que l’impact négatif de la réticulation par FA sur la dégradabilité était deux fois plus important que celui du à la teneur en lignines (Casler and Jung, 1999, 2006; Casler et al., 2008).
En outre, les études de modélisation de Grabber et al. (1998b) ont aussi révélé que les diférulates (diFA) qui pontent entre elles des chaines d’arabinoxylanes limitent aussi le degré de dégradation par les enzymes. Dans le même ordre d’idée, une étude sur le son de blé a indiqué que le degré de dégradation des xylanes par des endoxylanases était liée au taux de substitution des arabinoses et à la présence de diférulates (Beaugrand et al., 2004).
L’utilisation d’estérases a permis de partiellement surmonter cette limitation en clivant les liaisons esters mettant en jeu des diFA.
Ces observations du rôle essentiel de FA sur la réticulation des parois ainsi que sur la dégradabilité des parois laissent penser que la réduction des ponts FA offre une possibilité d’amélioration de la qualité des fourrages tout comme du potentiel de saccharification. La sélection de génotype qui présente de faibles concentrations en ponts FA semble être une approche raisonnable pour remplir cet objectif d’amélioration. Cette sélection demande a être développée en veillant cependant à ne pas impacter négativement la valeur agronomique des plantes (Casler, 2005).

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE 
1. Le maïs, une ressource essentielle pour l’alimentation animale et pour la production de biocarburant
1.1. Les avantages de la culture du maïs
1.2. La production du maïs et ses débouchés
1.3. La production du biocarburant issu du maïs
2. Maïs, valeur alimentaire et dégradabilité de paroi 
2.1. La valeur alimentaire du maïs
2.2. Dégradabilité de parois et composition pariétale
2.3. Etude des lignocelluloses chez le maïs
3. Objectifs et travail de thèse 
Recherche des facteurs biochimiques explicatifs des variations de dégradabilité de parois, dans un contexte de teneur en lignine fixée, et impacts sur les performances agronomiques chez le maïs
Etude de la mise en place de la lignification et de la réticulation de la paroi au cours du
développement
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Polymères et assemblages moléculaires de la paroi végétale
1.1. La cellulose
1.2. Les hémicelluloses
1.3. Les lignines
1.4. Les acides p-hydroxycinnamiques
2. Mise en place de la lignification au cours du développement
2.1 – Mise en place des parois au cours du développement cellulaire
2.2 – Mise en place des tissus lignifiés au cours du développement d’un entre nœud de maïs
3. Les facteurs clés explicatifs des variations de dégradabilité des parois
3.1. Impact de la composition monomérique et de la structure des lignines sur la dégradabilité des parois
3.2. Impact sur la dégradabilité des parois d’une spécificité forte des parois de graminées : la présence d’acides p-hydroxycinnamiques
3.3. Impact des différents tissus d’une tige sur la dégradabilité des parois
CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES
1. Le matériel végétal 
1.1. Les 8 lignées recombinantes (LR) choisies dans la population issue du croisement entre F286 et F7012
1.2. Les 7 lignées naturelles de maïs choisies
2. Les expérimentations au champ 
2.1. Culture et récolte en plantes entières sans épis pour les 8 LR
2.2. Culture et prélèvements au cours du développement des entrenœuds pour les 7 lignées
3. Les méthodes d’analyses biochimiques mises en œuvre
3.1. Détermination de la teneur en paroi et obtention du résidu pariétal (RP)
3.2. Détermination de la teneur en lignines
3.3. Détermination de la composition monomérique des lignines par thioacidolyse
3.4. Détermination des teneurs en acides p-hydroxycinnamiques
3.5. Estimation des dégradabilités
4. Les méthodes utilisées pour l’étude histologique
4.1. Coupe des tiges de maïs
4.2. Coloration des coupes de tiges de maïs
4.3. Acquisition des images
4.4. Analyses des images
5. Les méthodes d’analyses statistiques des résultats
5.1. Analyse de variance au sein des 8 LR ainsi que les deux lignée parents
5.2. Analyse de variance au sein des trois lignées prélevé en cinétique
5.3. Corrélations et régressions multiples
CHAPITRE III : RECHERCHE DES FACTEURS BIOCHIMIQUES EXPLICATIFS DES VARIATIONS DE DEGRADABILITE DE PAROI DANS UN CONTEXTE DE TENEUR EN LIGNINES FIXE ET IMPACTS SUR LES PERFORMANCES AGRONOMIQUES CHEZ LE MAÏS 
INTRODUCTION
1. Recherche des facteurs biochimiques explicatifs des variations pour la dégradabilité
des parois de maïs dans un contexte de teneur comparable en lignine (Article I)
2. Variabilité génétique pour les caractéristiques agronomiques et études des relations
avec les facteurs biochimiques pariétaux et la dégradabilité des parois
2.1. Variabilité génétique pour les facteurs morphologiques au sein des 10 génotypes93
2.2. Etude des relations entre les facteurs morphologiques et les facteurs biochimiques
2.3. Relations entre les facteurs morphologiques et la dégradabilité de paroi
CONCLUSION 
CHAPITRE IV : MISE EN PLACE DES PAROIS, DE LEUR LIGNIFICATION ET DE LEUR RETICULATION AU SEIN DE LA TIGE DE MAÏS PENDANT LE DEVELOPPEMENT
INTRODUCTION
1. Etude cinétique de la mise en place de la lignification des parois et les différents composants pariétaux au cours du développement des plantes (Article II)
2. Etude cinétique de la distribution spatiale des lignines au sein des entrenœuds de maïs par analyse automatique d’images de coupes colorées au Fasga
2.1. Color quantification of Fasga stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem (Article III)
2.2. Analyse anatomique par granulométrique en niveau de gris
2.3. Analyse cinétique de la distribution spatiale des lignines au sein des entrenœuds des trois génotypes de maïs F324, F66 et F7037
2.4. Analyse des relations entre la dégradabilité de la paroi et les facteurs biochimiques et anatomiques pariétaux
CONCLUSION 
CHAPITRE V : SYNTHESE – TRAVAUX A POURSUIVRE – DISCUSSION GENERALE
1. Compréhension de la lignification
1.1. Développements méthodologiques autour de l’estimation de la lignification
1.2. Mise en place des parois et de leur lignification au cours du développement de l’entrenœud de maïs
2. Facteurs explicatifs des variations de dégradabilité des parois et mise en place de la lignification des parois au cours du développement 
2.1. Facteurs biochimiques explicatifs des variations de dégradabilité de paroi des plantes au stade ensilage
2.2. Mise en place de la lignification des parois au cours du développement
2.3. Variabilité génétique de la distribution spatiale des lignines au sein de l’entrenœud
2.4. Mise en place de p-coumaroylation des parois
2.5. Comparaison schématique de F324, F66 et F7037 au cours du développement
3. Travaux à poursuivre à plus ou moins long terme
3.1. Complément de l’analyse cinétique de la mise en place des parois
3.2. Démonstration de l’effet de la proportion de liaisons β-O-4 sur la dégradabilité
3.3. Mise en évidence de l’effet de l’acide p-coumarique sur la performance des parois secondaires
4. Comment moduler les différentes cibles mises à jour dans cette étude et aller vers une amélioration de la dégradabilité des parois
4.1. Modulation de la proportion de liaisons β-O-4 au sein du polymère
4.2. Modulation de la p-coumaroylation
4.3. Distribution ciblée de la lignification au sein des différents tissus
CONCLUSION GENERALE 
REFERENCES 

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