RECHERCHE DES CONSTITUANTS CYTOTOXIQUES DE Vandamena

Méthode basée sur les mécanismes d’action

                      La division cellulaire est contrôlée pa figurent les CDK (cycline-dependent kinases consiste à inhiber un enzyme particulier jugé crucial dans la division cellulaire. La figure dessous montre les CDK les plus pertinents dans cette division cellulaire, et qui peuvent servir de cibles thérapeutiques dans la recherche de nouvelles molécules anticancéreuses [Meijer, 2000]. National Cancer Institute (USA), beaucoup plus étendue, utilise 60 différentes souches céreuses [Kinghorn et al, 1999]. Sur le plan expérimental, il existe deux : la méthode colorimétrique utilisant l’absorption du rouge neutre par les cellules vivantes, et la méthode radioactive utilisant l’incorporation de la thymidine tritiée d cellules vivantes. On teste généralement deux concentrations, en l’occurrence 1µg/mL et/ou 10µg/mL, puis on détermine le pourcentage d’inhibition par rapport au témoin. En règle générale, un extrait ayant un pourcentage d’inhibition supérieur à 80 pour une concentration de 10 µg/mL est considéré comme actif. Dans ce cas, on détermine la concentration ) par la méthode de régression linéaire. La division cellulaire est contrôlée par une multitude d’enzymes parmi lesquelles dependent kinases).

La RMN à onde continue ou RMN à balayage de champ

                 D’après l’équation {2}, on peut obtenir une résonance de deux façons : (i) faire varier ν0 ou (ii) faire varier B0. Les premiers appareils de RMN de 60 à 100 MHz fonctionnaient par onde continue. Cette technique consiste à soumettre l’échantillon à analyser à une radiation électromagnétique de fréquence ν0 très stable, et à faire varier le champ magnétique appliqué B0. Le choix de cette technique vient du fait que, sur le plan pratique, il est difficile de maintenir B0 très stable

Exemple de démarche à suivre pour l’interprétation des spectres de RMN

                  A la suite de différents ateliers qu’elle a encadrés à Madagascar et à Maurice depuis 1993, Dr Marie-Thérèse MARTIN a proposé une démarche générale pour l’interprétation des spectres de RMN d’un produit :
Déterminer le nombre d’insaturation(s) à partir de la formule brute CxHyNZ en appliquant la formule suivante : X-Y/2 + Z/2+1 {8}
Faire un spectre de 13C
Faire un spectre corrélé proton-carbone HMQC ou HSQC et reporter sur la dimension carbone les δ de ces derniers, ensuite faire correspondre les protons avec les carbones qui les portent.
Sur le spectre proton marquer en dessous de chaque signal la fréquence du carbone qui les porte et mettre en évidence les protons géminés non équivalent ;
Faire un spectre COSY et relever les enchaînements protoniques. Regarder s’il y a des motifs qui peuvent déjà être déterminés : cycle aromatique para-disubstitué, cycle aromatique 1,2,4-trisubstitué, double liaison, etc. ;
Faire un spectre HMBC et reporter sur la dimension carbone le déplacement chimique de ces derniers, ensuite reporter dans la dimension proton les déplacements chimiques de carbone qui les portent ;
Confirmer les enchaînements déjà trouvés en COSY à l’aide du spectre HMBC ;
En partant de la partie identifiée de la molécule reconstituer son squelette ;
Certaines parties de la molécule peuvent être plus explicites que d’autres : les aromatiques permettent de déterminer la position des substituants, les protons d’un méthoxy ne corrèlent qu’avec le carbone qui le porte cette fonction, les protons d’un méthyle corrèlent avec les carbones en α et an β (2 J et 3 J) ;
Faire un spectre NOESY et relever les différentes sortes de tache NOE équilibre conformationel, échange COSY. Noter l’intensité des corrélations entre protons géminés et commencer par l’interprétation des taches les plus intenses. Une structure est déterminée lorsque tous les éléments déduits de différents spectres convergent.

Matériel végétal

                    La plante qui a servi à notre étude a été récoltée à Sakaraha en octobre 2005. Elle a été identifiée sous le nom Salacia leptoclada par Armand Rakotozafy. Un herbier a été conservé au Laboratoire de Chimie Appliquée sous le N° FDU 051 et à l’IMRA sous le numéro MAD115. C’est un arbrisseau glabre à feuilles persistantes, rameaux noirâtres, parsemés de lenticelles peu saillantes, très petites, les ultimes grêles de moins de 1mm de diamètre. Feuilles opposées, parfois subopposées, concolores, vertes membraneuses, pétiole5-10mm, de long : limbe ovale ou ovale- lancéolé (3-8,5 x 2-4,4 et jusqu’à11 x 5,3cm) ou plus étroit (5,3-9 x 2,2-3 cm) à plus grande largeur au milieu ou plus souvent au-dessous du milieu, plus ou moins en coin ou arrondi à la base non décurrente, atténué- obtus ou courtement acuminé au sommet ; dents marginales nombreux (15-20 par bord), denses, petites et peu saillantes mais toujours bien visibles. Fascicules multiflores, parfois courtement pédonculés ; pédicelles grêles, mais courts (3-5mm) ; Fleurs petites (5-6mm diam). Sépales très petits 5-6 fois plus petits que les pétales oblongs (3 x 1,5mm), au moins 2 fois plus longs que les larges. Disque très court. Etamines un peu plus hautes que le style, parfois à anthères coalescentes audessus du style de 1mm de haut. 6 ovules au moins dans chaque loge de l’ovaire. Baie globuleuse, petite (au plus 10mmde diam.); péricarpe plus mince, avec les mêmes vaisseaux en filaments soyeux que sur S. madagascariensis. Graines nombreuses (15-20 par fruit), ovoïdes ou cylindracées, petites (au plus 3,5 x 1,5mm) sans albumen et à cotylédons unis en une seule masse comme S. madagascarienssis [H.Perrier de la bâthie(1946)] Cette plante est connue sous le nom vernaculaire : Vandamena et Malainkevitsa dans la région de Sakaraha. Elle est traditionnellement utilisée pour guérir la plaie et combattre le paludisme en faisant une décoction de la partie aérienne de la plante dans un 1itre d’eau au minimum. On l’administre sous forme de tisane ou « tambavy ».

DISCUSSION

                     Le principe cytotoxique de Vandamena a été identifié comme étant une quinonemethide triterpène qui est caractéristique de la famille botanique des Celastraceae et Hyppocrateaceae. Il est très probable que la présence du noyau quinonique confère à cette famille chimique une importante activité cytotoxique. Il est intéressant de signaler qu’une autre plante dénommée Vandamena a été récoltée à Sakaraha, et a été identifiée comme étant un Diospyros sp. Le mot Vandamena vient du fait que la décoction de la plante possède une coloration rouge sang caractéristique. L’étude de la plante Diospyros a permis de connaître que le constituant cytotoxique est aussi une quinone mais de type différent. Ainsi, la coloration rouge des quinones a donné naissance au nom vernaculaire Vandamena, et les produits correspondants sont cytotoxiques. Il s’agit là d’un résultat intéressant sur le plan du savoir traditionnel en rapport avec les connaissances modernes. Ceci permettre d’orienter les collectes futures en vue de cibler les plantes qui peuvent présenter une originalité dans les constituants chimiques. C’est sur cette recherche de la diversité chimique que reposera toute la réussite de la découverte de nouveaux médicaments. Sur le plan mécanistique, les quinones pourraient jouer le rôle d’intercalants de l’ADN grâce à sa structure plane, ce qui expliquerait leurs activités cytotoxiques. Les quinones possèdent également des activités antipaludiques, et comme exemple pertinent, on peut citer l’atovaquone dont la structure a été inspirée de celle du lapachol isolé de Tabebuia sp originaire du Brésil et utilisée dans le traitement de la malaria.

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE 1 : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. La maladie cancéreuse
1.1. Définition
1.2. Evolution de la maladie
1.3. Chimiothérapie anticancéreuse
1.4. Méthode de la recherche des Molécules anticancéreuses
2. les terpenoïdes
2.1. Définition
2.2. Classification
2.3. Biogenèse
2.4. Biogenèse des quinones triterpènes
3. Méthodes spectroscopiques de détermination des structures
3.1. RMN 1D et 2D
3.2. Application à la détermination de structure
3.3. Spectrométrie de masse
CHAPITRE 2 : ETUDES DE VANDAMENA
1. Travaux antérieurs sur le genre salacia
2. Matériels et méthodes
2.1. Solvants, réactifs et adsorbants
2.2. Matériel végétal
2.3. Isolement du principe actif
3. Résultats 
4. Analyse structurale de la molécule bioactive isolée
4.1. Interprétation du spectre de masse
4.2. Interprétation de la RMN 1D et 2D
5. Discussion 
CONCLUSION
REFERENCES
ANNEXES

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