Recherche des anticorps et des antigenes urinaires de legionella pneumophila

LES INFECTIONS RESPIRATOIRES BASSES

Les infections respiratoires basses se définissent comme une atteinte du parenchyme pulmonaire, des bronches et de la trachée [20].
Les pneumopathies aiguës sont retrouvées chez 80% des malades immunodéprimés. Au stade précoce de la maladie, ce sont surtout les bactéries qui sont incriminées dans les pneumopathies.
Au stade avancé, on note une pneumocystose et une tuberculose à Mycobacterium tuberculosis.
Au stade tardif, on observe une tuberculose à Mycobactéries atypiques.
Les pneumopathies aigues bactériennes peuvent survenir à n’importe quel stade de la maladie [91].

Germes en cause

Dans les pneumopathies aigues bactériennes de l’immunodéprimé, les germes les plus fréquemment rencontrés sont les suivants :
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sp, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Mycobactérium sp, Staphylococcus aureus [91].
On note l’émergence de bactéries responsables de pneumopathies atypiques qui sont : Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae [11, 22, 24,73].
Le rôle de ces germes dans les pneumopathies aigues de l’immunodéprimé n’est pas encore bien connu car de diagnostic difficile.

LEGIONELLA PNEUMOPHILA

HABITAT 

L. pneumophila et d’autres espèces sont des bactéries d’origine hydro tellurique. Elles sont présentes à l’état naturel dans les eaux douces (lacs et rivières). A partir des réservoirs naturels, la bactérie colonise les systèmes de climatisation défectueux, les bains à remous, les équipements des stations thermales, les fontaines et certains appareils dans les hôpitaux (humidificateurs, respirateurs,…).

CARACTERES BACTERIOLOGIQUES

Morphologie 

L. pneumophila est un bacille à Gram négatif, faiblement coloré, non sporulé, non acido-résistant, non capsulé, de 0,3 à 0,9 µm de large sur 2 à 20 gm de long.
L. pneumophila est l’espèce type de la famille des Legionellaccae. Cette famille comporte 46 espèces et 64 sérogroupes.

Pathogénie

L. pneumophila est une bactérie intracellulaire facultative. Elle infeste et se multiplie dans les macrophages alvéolaires, les monocytes et les cellules épithéliales chez l’homme.

Généralités

La contamination des personnes exposées se fait essentiellement par inhalation d’eau contaminée diffusée en aérosol. Ces aérosols atteignent les alvéoles pulmonaires ; les bactéries infestent les macrophages alvéolaires, survivent et se multiplient dans les phagosomes à pH neutre. L’inhibition de la fusion des phagosomes et des vacuoles lysosomiales permet la survie intracellulaire de L. pneumophila et entraîne la destruction des macrophages.
Le déclenchement d’une infection dépend de la pathogénicité de la souche, de l’état immunitaire du sujet exposé et de la concentration de bactéries dans l’eau.

L’immunité

L’immunité contre L. pneumophila est essentiellement de type cellulaire T dépendant : une réaction d’hypersensibilité retardée a été mise en évidence chez le cobaye.
La croissance intramacrophagique est inhibée par des lymphokines activant les macrophages.
Il existe également une immunité humorale passive transférable expérimentalement chez le cobaye mais non protectrice vis-à-vis de l’infection par des bactéries virulentes [10, 34, 35].
Les anticorps de type IgG, IgM et IgA sont probablement opsonisants en synergie avec le complément.
Les anticorps sont faibles ou absents chez les immunodéprimés et peuvent persister à des taux élevés toute la vie chez certains malades [2].

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE 1341

Prélèvements 

Les prélèvements d’où peuvent être isolés les légionelles sont : le LBA (Lavage Broncho Alvéolaire), les expectorations, les aspirations trachéales, les aspirations bronchiques, les biopsies pulmonaires, le liquide pleural.

Diagnostic direct

Détection de L. pneumophila dans les prélèvements 

Immunofluorescence directe (IFD)

Les légionelles sont des bacilles Gram négatif faiblement colorés et la coloration de Gram réalisée sur un prélèvement pulmonaire ne permet pas d’évoquer le diagnostic.
L’examen direct des prélèvements cliniques est réalisé par IFD à l’aide d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux qui reconnaissent tous les sérogroupes de L. pneumophila.

Culture 

La culture des Légionelles est lente et difficile. Les légionelles sont des bactéries exigeantes nécessitant l’utilisation de milieux spécialisés. Le milieu de base est le milieu BCYE. Le délai de réponse est de 10 jours.
Les colonies de Légionelles présentent un aspect caractéristique dit en « verre fritté » lorsqu’elles sont observées à la loupe binoculaire.
L’identification des colonies est réalisée par IFD.
Les milieux peuvent être rendus sélectifs par adjonction d’antibiotique (vancomycine et colistine).
La culture demeure la méthode de certitude diagnostique. La spécificité est de 100% et elle est sensible à 50%-80% 1341.

Diagnostic indirect

Les anticorps apparaissent en 4-8 semaines après le début de la maladie.
Les anticorps détectés sont en majorité dirigés contre le lipopolysaccharide (LPS) de la membrane externe des légionelles.
La technique d’immunofluorescence indirecte reste la méthode de référence, mais des techniques ELISA sont actuellement proposées [47].
Une ascension du titre d’anticorps spécifiques anti-L. pneumophila (>4N) dans un sérum tardif (prélevé 4 semaines plus tard) soit un titre unique >256 en IFI, affirme le diagnostic. Pour un titre élevé précoce la sensibilité est faible [10, 45,61].
Avantage : le sérodiagnostic permet un diagnostic de légionellose dûe à des sérogroupes de Legionelles non diagnostiqués par une recherche d’antigènes urinaires ou difficilement isolés par culture [47]. Inconvénient : le sérodiagnostic ne permet qu’un diagnostic tardif voire rétrospectif. De nombreuses réactions croisées en IFI ont été décrites avec : les Mycobactéries, les Leptospires, les Chlamydia, les Mycoplasma, Citrobacter, Campylobacter et Coxiella burnetii [47].

SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES 

L. pneumophila possède une bêtalactamase d’où une résistance aux bêtalactamines.
Il présente une résistance naturelle à la vancomycine et à la colistine [2].
Trois méthodes peuvent être utilisées pour déterminer la sensibilité des légionelles aux antibiotiques : à les tests extracellulaires ; les tests intracellulaires ; les études de traitement des cobayes infectés. Les légionelles étant des bactéries à développement intracellulaire, l’étude in vitro de la sensibilité aux antibiotiques de ces bactéries ne peut être directement corrélée avec l’activité clinique des molécules. En plus la présence de charbon, d’extrait de levures ainsi que l’acidité des milieux ont un effet inhibiteur pour certains antibiotiques.
Le traitement des formes non sévères fait généralement appel à l’érythromycine ou à d’autres macrolides (clarithromycine, azithromycine). Pour les légionelloses sévères on utilise soit des fluoroquinolones (ciprofloxacine, ofloxacine, lévofloxacine, péfloxacine), soit une association de fluoroquinolones et de rifampicine ou de macrolides et de rifampicine.

MYCOPLASMA PNEUMONIAE

HABITAT

Transmis par contage, M pneumoniae colonise les voies respiratoires basses et provoque des infections respiratoires d’allure endémique du fait de la persistance. Cependant, il n’appartient pas à la flore commensale des voies respiratoires et son rôle pathogène est certain [6]. Ils sont fréquents dans la nature et capable de vivre dans des conditions inhabituelles [78].

CARACTERES BACTERIOLOGIQUES

Taxonomie

M pneumoniae appartient à la classe des Mollicutes ou Tenericutes (regroupant des bactéries dépourvues de paroi), à l’ordre des Mycoplasmatales, à la famille des Mycoplasmataceae qui comprend 85 espèces de genre Mycoplasma et 5 espèces de genre Ureaplasma [7].

Morphologie

Ce sont les microorganismes les plus petits (150-250 nm) qui soient capables de pousser sur milieu acellulaire.
Leur caractéristique inhabituelle est l’absence de paroi rigide. La membrane de M. pneumoniae présente une structure trilamellaire, contenant des glycolipides, des glycoprotéines et des stérols qui assurent sa fluidité. Il n’est pas colorable au Gram et n’est pas visible au microscope photonique. Sa morphologie peut par contre être appréciée à l’examen en contraste de phase ou mieux au microscope électronique où on note la présence d’une structure terminale à extrémité effilée : le « tip » qui permet l’adhésion aux différents supports (cellules cibles et verre).

Caractères culturaux 

M pneumoniae est une bactérie très exigeante. L’isolement se fait sur milieu artificiel (contenant des extraits de levure, du sérum et du stérol) entre 35° et 37°C, en atmosphère micro aérophile (95% N2 ; 5% CO2) ou sous 5% de CO2 .
Il est très sensible aux variations de pH du milieu. Les milieux proposés sont : le milieu de Hayflick, le milieu SP 4 et le milieu PPLO.

PHYSIOPATHOLOGIE

Pouvoir pathogène naturel

M pneumoniae est responsable de pneumonie atypique atteignant des adolescents et des adultes jeunes sans antécédents.
Le début est progressif en quelques jours. On observe des signes d’atteinte des voies aériennes supérieures, parfois une atteinte du tympan (méningite bulleuse).
Le tableau clinique associe une fièvre, des signes généraux variables, une toux sèche, incessante et invalidante. L’examen physique est pauvre avec quelques râles [32].
A la radiographie du thorax, on observe une opacité hétérogène localisée, réticulo-micro-nodulaire, de topographie hilo-basale.
La numération sanguine montre une anémie hémolytique, le plus souvent avec un test de Coombs positif et agglutinines froides positives.
On note d’autres complications inhabituelles telles que les encéphalites, un rush ou érythème multiforme [78].
L’infection est le plus souvent bénigne, voire inapparente. Cependant on note des formes graves prenant l’allure d’une pneumonie bactérienne nécrosante, des formes abcédées, des détresses respiratoires et des épanchements pleuraux chez les sujets à risque (immunodéprimés).

Pathogénie

Elle diffère beaucoup de celle des autres formes de pneumonie car elle est limitée à la muqueuse bordant les voies respiratoires.
Il existe un infiltrat de cellules mononucléées entourant les bronches et les bronchioles infectées entraînant une atteinte de type broncho-pneumopathie.
Certains patients immunodéprimés infectés par M pneumoniae n’ont pas d’infiltrat pulmonaire visible, ce qui suggère que la réponse immune doit jouer un rôle dans les manifestations de la maladie.
L’infection à Mycoplasmes n’a pas d’action destructrice sur les tissus, c’est la fonction ciliaire qui est inhibée. On pense que cette inhibition est due à l’élaboration de substances toxiques comme la peroxydase d’hydrogène.
M pneumoniae déclenche les principales cellules de la réponse inflammatoire que sont les lymphocytes et les polynucléaires neutrophiles. On note également une auto-immunité par antigénicité croisée entre la membrane des Mycoplasmes et les membranes humaines.

IMMUNITE

Les infections entraînent une immunité protectrice partielle, ce qui explique la prépondérance chez l’enfant de plus de 6 mois et l’adulte jeune [36].
La protection paraît beaucoup plus liée à la présence d’IgA sécrétoires au niveau des sécrétions respiratoires qu’à celle d’anticorps sériques [3, 8].

DIAGNOSTIC AU LABORATOIRE

Le diagnostic biologique d’une infection à M pneumoniae est plus souvent réalisé par la sérologie que par la culture ou la PCR.

Prélèvements 

La recherche des Mycoplasmes dans les expectorations est à déconseiller, en raison de leur contamination par de nombreuses bactéries.
Ils sont à rechercher dans : les prélèvements de gorge, les aspirations nasopharyngées chez le jeune enfant, le lavage broncho alvéolaire, le brossage endobronchique [39].
Quelle que soit la méthode de prélèvement, elle doit ramener des cellules auxquelles les Mycoplasmes adhèrent. Une fois effectués, les prélèvements sont mis en culture sans délai pour obtenir de meilleurs résultats.

CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE

CARACTERISTIQUES BACTERIOLOGIQUES

Taxonomie 

Le genre Chlamydophila constitue avec le genre Chlamydia la famille des Chlamydiaceae.
Le genre Chlamydia regroupe 3 espèces dont Chlamydia trachomatis est la seule espèce d’intérêt médical.
Le genre Chlamydophila regroupe 6 espèces dont 2 sont responsables de pneumopathies : C. pneumoniae, C. psittaci.
Cette classification a été proposée par Everett et Coll. en 1999. Elle est fondée sur de récentes découvertes, concernant l’analyse des séquences des gènes codant pour l’ARN ribosomal.

Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: GENERALITES
I-INFECTION A VIH ET LES INFECTIONS RESPIRATOIRES AIGUES
I- 1 -INFECTION A VIH
I-2-LES INFECTIONS RESPIRATOIRES BASSES
I-2-1-Germes en cause
II-LEGIONELLA PNEUMOPHILA
II-1-HABITAT
II-2-CARACTERES BACTERIOLOGIQUES
II-2-1-Morphologie
II-2-2-Caractères culturaux
II-2-3-Caractères biochimiques
II-2-4-Caractères antigéniques
II-3-PHYSIOPATHOLOGIE
II-3-1-Pouvoir pathogène naturel
II-3-1-1-Fièvre de Pontiac
II-3-1-2-Formes extra pulmonaires
II-3-1-3-La maladie des légionnaires
II-3-2-Pathogénie
II-4-L’IMMUNITE
II-5-DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE
II-5- 1 -Prélèvements
II-5-2-Diagnostic direct
II-5-2-1-Détection de L. pneumophila dans les prélèvements
II-5-3-Culture
II-5-4- Diagnostic indirect
11-6-SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
III-MYCOPLASMA PNEUMONIAE
III- 1 -HABITAT
III-2-CARACTERES BACTERIOLOGIQUES
111-2- 1 -Taxonomie
III-2-2-Morphologie
III-2-3-Caractères culturaux
III-2-4-Caractères métaboliques
III-2-5-Caractères antigéniques
III-3-PHYSIOPATHOLOGIE
III-3-1-Pouvoir pathogène naturel
III-3-2-Pathogénie
III-4-IMMUNITE
III-5-DIAGNOSTIC AU LABORATOIRE
III-5-1-Prélèvements
III-5-2-Diagnostic direct
111-5-2-1- Coloration
III-5-2-2-Recherche d’antigènes
III-5-2-3-Détection des acides nucléiques
III-5-2-4- Culture
III-5-3-Diagnostic indirect ou sérologique
III-5-3-1-Réaction de fixation de complément
111-5-3-2-ELISA et immunofluorescence indirecte (IFI)
III-5-3-3-L ‘agglutination passive de particules sensibilisées
III-6-SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
IV-CHLAMYDOPHHA PNEUMONIAE
IV-1-CARACTERISTIQUES BACTERIOLOGIQUES
IV-1-1 -Taxonomie
IV-1-2-Morphologie et cycle de développement
IV-1-3-Caractères antigéniques
IV-2-PHYSIOPATHOLOGIE
IV-2-1-Manifestations cliniques
IV-2-1-1- Les infections respiratoires
1V-2-1-2-L’athérosclérose
IV-2-2-Pathogénie
IV-2-2-1 Mécanismes immunopathologiques de l’infection
IV-2-2-2-Notion de persistance
IV-3-IMMUNITE
IV-4-DIAGNOSTIC AU LABORATOIRE
IV-4-1-Diagnostic bactériologique
IV-4-1-1-Prélèvements
IV-4-1-2-Détection des antigènes
IV-4-1-3-Isolement
IV-4-1-4-Détection des acides nucléiques
IV-4-2- Sérologie
IV-4-2-1-Techniques de détection des antigènes de genre
IV-4-2-2-Techniques de détection d’antigènes d’espèces
IV-4-2-3-Critères de sérodiagnostic de C. pneumoniae
IV-5-SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
V-CINETIQUE DES ANTICORPS AU COURS D’UNE INFECTION
V-1-CINETIQUE DE LA PRODUCTION DES ANTICORPS
V-2-INTERPRETATION DU SERODIAGNOSTIC
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
CHAPITRE I : METHODOLOGIE
I – MATERIEL ET REACTIFS
I-1- MATERIEL
I-1-1-Cadre d’étude
I-1-2-Population cible
I-1-3-Prélèvements
I-1-3-1- Sérum
I-1-3-2- Urine
I-1-4-Matériels contenus dans les Kit
I-1-5-Matériels supplémentaires de laboratoire
I-2-REACTIFS
II- METHODOLOGIE
II-1-PRINCIPE DE L’ELISA
II-2-RECHERCHE DES ANTICORPS ET DES ANTIGENES URINAIRES DE LEGIONELLA PNEUMOPHILA
II-2-1- Recherche des anticorps anti-Legionella pneumophila dans le Sérum
II-2-1-1- Procédure d’étude
II-2-1-2-Interprétation des résultats
II-2-2-Recherche des antigènes urinaires de Legionella pneumophila serogroupe
II-2-2-1- Procédure d’étude
II-2-2-2-Interprétation des résultats
II-3-RECHERCHE DES ANTICORPS
ANTI-MYCOPLASMA PNEUMONIAE
II-3-1-Recherche des IgM anti-Mycoplasmes
II-3-1-1-Procédure d’étude
II-3-1-2-Interprétation des résultats
II-3-2-Recherche des IgG anti-Mycoplasmes
II-3-2-1-Procédure d’étude
II-3-2-2-Interprétation des résultats
II-4-RECHERCHE DES ANTICORPS ANTI-CHLAMYDOPHILA PNE UMONIAE
II-4-1-Recherche des IgM anti-Chlamydophila pneumoniae
II-4-1-1-Procédure d’étude
II-4-1-2-Interprétation des résultats
II-4-2-Recherche des IgG anti-Chlamydophila pneumoniae
II-4-2-1-Procédure d’étude
II-4-2-2-Interprétation des résultats
CHAPITRE H : RESULTATS
IANTIGENURIE ET SEROLOGIE DES LEGIONELLES
I-1- ANTIGENURIE
I-2-IMMUNOGLOBULINES M ET G ANTI-LEGIONELLES
III MMUNOGLOBULINE M ET G ANTI-MYCOPLASMES
IIII MMUNOGLOBULINE M ET G ANTI-CHLAMYDOPHILA
CHAPITRE HI : DISCUSSION
IAPPROCHE METHODOLOGIQUE
IIRECHERCHE D’ANTIGENE ET D’ANTICORPS
II-1-LEGIONELLA PNEUMOPHILA
II-2-MYCOPLASMA PNEUMONIAE ET
CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE
III-RECHERCHE D’ANTIGENE ET ISOLEMENT DE LA BACTERIE
IV- ETUDE COMPAREE DU SERODIAGNOSTIC ET
L’ISOLEMENT DES BACTERIES INTRACELLULAIRES
IV-1-LEGIONELLA PNEUMOPHILA
IV-2-MYCOPLASMA PNEUMONIAE
IV-3-CHLAMYDIPHILA PNEUMONIAE
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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