Soutenance mémoire
Historique et évolution des données sur les NATs
Au cours des dernières décennies, la recherche sur les arylamine-N-acétyltransférases a permis des découvertes importantes qui ont aidé les scientifiques à mieux intégrer le mécanisme polymorphique du métabolisme des médicaments et des xénobiotiques par les enzymes de métabolisation des xénobiotiques (EMX).
Les premières références sur les réactions de N-acétylation par les NATs chez l’Homme remontent à 1926 [Muenzen et coll.1926].
Le polymorphisme des N-acétyltransférases représente l’un des exemples de variation pharmacogénétique décrits les plus documentés, depuis sa découverte au début des années 1950, en même temps que celle de la grande efficacité de l’isoniazide (INH) dans le traitement de la tuberculose [Hughes et coll. 1954].
Il a été démontré, suite à l’administration d’isoniazide, que si de nombreux patients excrétaient rapidement des dérivés d’INH sous forme de métabolites conjugués inactifs, d’autres conservaient plus longtemps une concentration plasmatique plus élevée non transformée, en relation avec l’élimination moins efficace du médicament. Des études quantitatives, par le calcul du rapport entre métabolites conjugués et métabolites non conjugués, ont vite montré que les populations étudiées se divisaient en 2 groupes d’individusen ce qui concerne la vitesse d’élimination de l’INH : les uns dits acétyleurs rapides, lesautres dits acétyleurs lents de l’INH (Figure 4).
Localisation, expression et structure des NAT
Les deux formes enzymatiques des N-Acétyltransfèrases sont codées par deux gènes différents, la NAT1 et la NAT2, décrits chez l’homme pour la première fois par Grant etcollaborateurs en 1981 [Grant et coll. 1983]. Ces deux gènes sont séparés par 25 kb et localisés sur le bras court du chromosome 8 plus précisément dans la région 8p22 [Hichmann et coll. 1994, Boukouvala et Fakis 2005, Westwood et coll. 2006, Minchin et coll. 2007, Simet coll. 2007 et coll. 2008, Grant 2008, Sim et coll. 2008a et 2008b]. Un troisième gène, laNATP1, a été identifié sur le même chromosome et constitue probablement un pseudogène. Il présente 79 et 80 % d’identité nucléotidique avec les NAT1et NAT2respectivement [Grant 2008]. Ce pseudogène renferme plusieurs mutations, expliquant son défaut d’expression.
L’expression des gènes NAT1 etNAT2donne naissance à deux protéines fonctionnelles de 290 acides aminés (aa) qui ne différent que par 55 acides aminés au niveau de la région Cterminale. Le gène NAT1a une taille de 33 kDa et le NAT2, une taille de 31 kDa. Ces deux gènes partagent 87 % d’homologie nucléotidique dans la région codante qui se traduit par 81 % d’homologie au niveau de la séquence des acides aminés [Blum et coll. 1990, Grant et coll. 1983 et 1997] (Figure 6).
Principales fonctions des N-Acétyltransfèrases
Les N-acétyltransférases (NATs) constituent une famille d’enzymes, qui comme leur nom l’indique, catalysent le transfert d’un groupement acétyle issu de l’acétylcoenzyme A, sur l’azote du groupement amine primaire (-NH2) ou hydrazine (-NH-NH2) d’une molécule aromatique ou arylamine receveuse (Figures 8). Le produit formé est une arylamide. [Rustanet coll. 2006, Grant 1993].
Déterminisme génétique de la N-Acétyltransférases de type 2 (NAT2)
On emploie le terme « polymorphisme » à partir du moment où une mutation ou une variation génétique présente une fréquence de plus de 1 % dans la population. Sur les trois milliards de bases du génome humain, 99,9 % sont identiques d’un individu à l’autre. Le reste (0,1%) représente les variations ou polymorphismes, pourcentage infime, mais de trois millions de nucléotides, qui sont à la base des différences entre les individus. Rappelons que les polymorphismes résultent de trois types de variations de la séquence d’ADN [Nebert et Bingham 2001]:
– des « polymorphismes simples de nucléotides (SNPs) » ou polymorphismes touchant un seul nucléotide, qui correspondent à des substitutions de nucléotides.
– des insertions ou des délétions de bases, qui peuvent impliquer une seule base ou des centaines ou des milliers de nucléotides.
– des délétions d’ADN répétitif (tandem repeats, minisatellites, microsatellites, AluIsegments qui sont des répétitions de séquences de paires, de triplets ou de quadriplets de nucléotides et qui s’enchaînent, répétées à l’identique).
Les récentes avancées acquises dans la connaissance de la génétique des NATs ont permis d’élucider certaines des bases moléculaires des différences phénotypiques de la N- acétylation observées chez l’homme. Il est maintenant bien connu que les gènes codant pour les NAT1 et NAT2 sont polymorphes et que ce polymorphisme génétique des NATs est bien identifié chez l’homme, le hamster, le lapin et la souris [Hein 1988, Grant et coll. 1992, Vatsis et coll. 1995, Roemer et coll. 2008, Weistenhofer et coll. 2008].
Les bases moléculaires du polymorphisme d’acétylation de la NAT2 sont devenues évidentes seulement après le clonage des gènes humains NATs et l’introduction des méthodes de génotypage telles que la technique de polymorphisme de longueur des fragments de restriction PCR-RFLP [Hickman and Sim 1991, Bell et coll. 1993, Lin et coll. 1993, Cascorbi et coll. 1995, Doll et coll. 1995], la technique du polymorphisme de conformation des simples brins générée par réaction de polymérisation en chaine ou PCR-SSCP [Lo-Guidice et coll. 2000], les essais de ligature des oligonucléotides [Bigler et coll. 1997], l’analyse des hétéroduplexes en temps réel basée sur la capillarité [Wikman et coll. 2001], ou le test de génotypage par TAqMan de Applied Biosystems [Doll et Hein 2001, 2002].
Treize substitutions nucléotidiques ou SNP ponctuelles ont été identifiées dans la séquence codante du gène humain NAT2dans différentes populations (c.191G>A, c.341T>C, c.590G>A, c.857G>A, c.803A>G, c.282C>T, c.481C>T, c.345C>T, c.403C>G, c.434A>C, c.481C>T, c.638G>A, c.838G>A). D’autres SNP ont été retrouvés mais à des fréquences faibles selon les groupes ethniques. Selon le consensus sur la nomenclature du gène NAT2 humain, les variants alléliques sont caractérisés par la combinaison d’un ou de quatre SNP présents dans le même allèle. Ainsi, 36 variants alléliques du gène NAT2existent selon la base de données sur la nomenclature des NATs. Parmi ceux-ci, la NAT2*4 est considérée comme l’allèle sauvage, responsable du phénotype acétyleur rapide. (http://www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT2.html ).
Les premières études de génotypage ont permis de mettre en évidence la présence des substitutions nucléotidiques c. 481C>T, c.590 G>A, c.857G>A et c.191G>A. Ces SNP sont appelés M1, M2, M3 et M4 respectivement et codent tous pour un phénotype d’acétylation lente.
Les allèles NAT2*11A, *12A, *12B, *12C et *13, sont considérés comme des allèles codant pour un phénotype rapide, car ils portent des mutations silencieuses (pas dechangement de la séquence de la protéine) ou ils conduisent à des changements non conservatifs d’acides aminés sans impact sur l’activité de la protéine (par exemple, la Lys substituée en Arg. dans la protéine NAT2*12) [Lin et coll. 1993, Hein et coll. 1994, Cascorbi et coll. 1996]. Les allèles NAT2*10, *11B, *12D, *17, *18 et *19 sont porteurs de mutations faux-sens avec un changement d’acides aminés ayant pour conséquence une diminution de l’activité enzymatique. Ainsi, ils sont classés allèles « lents » [Lin et coll. 1994, Doll et coll. 1995, Shishikura et coll. 2000]. Des études ont aussi démontré que les 24 autres allèles de NAT2codent pour des enzymes instables, d’activité réduite et par conséquent, sont considérés comme des phénotypes acétyleurs lents [Ferguson et coll. 1994, Hein et coll. 1994, Hickman et coll. 1995, Leff et coll. 1999, Fretland et coll. 2001].
Il est intéressant de souligner que l’ensemble des allèles de la NAT2 connus sont issus de la combinaison d’une vingtaine de SNP seulement, situés aux positions 111, 190, 191, 282, 341, 345, 364, 403, 411, 434, 481, 499, 590, 638, 759, 803, 838, 845, 857 et 859 de la région codante de la NAT2. Parmi ces allèles, treize sont considérés comme majeurs, c’est-àdire rencontrés à des fréquences significatives dans plusieurs populations [Vatsis et coll. 1997] (Tableau VI).
Association du polymorphisme génétique de la NAT2 avec des pathologies
Les gènes NATs et leurs polymorphismes ont suscité l’intérêt non seulement des pharmacologues, mais aussi d’épidémiologistes, de procéder à des investigations sur lesfacteurs étiologiques de maladies humaines complexes. Il est bien reconnu aujourd’hui que la susceptibilité individuelle à la maladie auto-immune, aux maladies neurodégénératives, cardiovasculaires et en particulier malignes, est déterminée par divers facteurs génétiques et environnementaux. L’influence de l’environnement est principalement exercée par l’exposition à des polluants, des produits chimiques industriels ou à des éléments nuisibles de l’alimentation [Sim et coll. 1995, Mohrenweiser 2004]. Comme les enzymes du métabolisme des xénobiotiques, les NATs catalysent les réactions métaboliques concurrentes, menant soit à la détoxication soit à la bioactivation de composés potentiellement nocifs qui entrent en contact avec le corps humain. C’est ainsi que, les liens possibles entre le polymorphisme du gène NAT2 et la prédisposition à certaines maladies dont on soupçonne les composantes environnementales ont été largement étudiés.
Le rôle des NATs dans la carcinogenèse chimique a été discuté au cours des dernières années par Hein et ses collaborateurs [Hein et coll. 2000, Hein 2002].
Ensuite, plusieurs études ont exploré l’impact des différences génétiques des NATs sur les risques de survenue de divers cancers, de la vessie [Sartorelli et coll. 1998, Hein 2006, Pandey et coll. 2007, Weistenhofer et coll. 2008], du colorectum [Borlak et Reamon-Buettner 2006a, Lilla et coll. 2006, Roemer et coll. 2008, Huang et coll. 2009, Slattery et coll. 2009], d’autres sites gastro-intestinaux [Jain et coll. 2007], du sein [Sillanpaa et coll. 2005], de la tête et du cou [Van Eyken et coll. 2007, Hernandez et coll. 2008], des poumons [Bouchardy et coll. 1998, Nikishina et coll. 2007], des ovaires [Delort et coll. 2008], mais aussi du lymphome, et d’autres états pathologiques tels que la maladie de Crohn, l’endométriose, les malformations congénitales, les maladies de Parkinson et le lupus [Boukouvala et Fakis 2005, Machida et coll. 2005, Carmichael et coll. 2006, Jensen et coll. 2006, Morton et coll. 2006, Fakis et coll. 2007 ]. La majorité des éléments de preuve des différences dans les risques dus au génotype NAT2est tirée d’études réalisées chez des sujets exposés à la fumée de cigarette, aux arylamines (2-naphtylamine et 4-aminobiphényle), ou chez des travailleurs exposés en milieu professionnel aux contaminants industriels comme la benzidine ou par l’intermédiaire des produits alimentaires (les amines hétérocycliques des viandes telles que le 2-amino-1-méthyl 6-phénylimidazo [4,5-β] pyridineou PhIP). Bien que le rôle de la NAT2, notamment dans l’étiologie du cancer, puisse paraître relativement bien défini, dans certains cas (par exemple, le phénotype lent de la NAT2 et le cancer de la vessie), dans d’autres cas, les données sont contradictoires. Ce n’est pas inattendu, étant donné qu’il existe, de nombreux facteurs en dehors du polymorphisme de la NAT2, également susceptibles de jouer un rôle dans la modulation du risque de cancer : (1) la variabilité dans d’autres systèmes enzymatiques pertinents tels que le CYP1A2, (2) le type et la durée de l’exposition, (3) des facteurs de susceptibilité toxicodynamique, (4) l’état clinique du malade, (5) la prise de médicaments, et (6) l’alimentation et les conditions de vie [Grant et coll. 1997].
L’influence du polymorphisme des NATs a été étudiée dans divers types de cancers. Le métabolisme de certains substrats communs aux N-acétyltransférases et au cytochrome P450 peut aboutir à la formation d’ions dits arylazoniums réactifs par perte spontanée d’un ion acétate. Ces ions se lient de façon préférentielle au niveau du résidu carboné 8 de la guanine.
L’adduit par sa masse, ne peut se glisser dans l’hélice d’ADN, et va donc entraîner une distorsion dans la structure hélicoïdale, perturbant gravement la transcription avec formation d’adduits covalents de l’ADN. La liaison de ces ions à l’ADN est considérée comme une source potentielle de mutations et de par là même accroîtrait la probabilité de cancérisation. Il a été démontré in vitro et in vivo que les N-Acétyltransférases 2 sont capables de participer à la formation de ces ions [Guengerich 1992]. Les précurseurs ainsi activés sont des amines cycliques et hétérocycliques provenant de sources environnementales telles que la fumée de cigarette, certains résidus de cuisson des aliments, ou encore des polluants industriels.
Les principales voies métaboliques conduisant à la formation de ces molécules réactives mettent en jeu, d’une part, des réactions de N-oxydation catalysées par les mono-oxygénases à cytochrome P-450 (en particulier les isoformes CYP1A1 et CYP1A2), et d’autre part, des réactions de N- et O-acétylation et de N-, O-transacétylation, potentiellement catalysées par les NAT2 et/ou les NAT1. La combinaison de ces activités enzymatiques peut induire l’apparition de composés acétoxyarylamine instables, à l’origine des ions arylazonium (Figure 12). D’autres activités enzymatiques pourraient également intervenir, en particulier de type cyclo-oxygénase, glucuronyltransférase et sulfotransférase. Par conséquent, toute variation dans l’activité de ces enzymes pourra potentiellement avoir des répercussions significatives sur le devenir des xénobiotiques qui auront pu pénétrer dans l’organisme [Grant 1993].
Au total, par la production de dérivés acétylés, les enzymes NAT1 et NAT2 doivent être considérées comme participant globalement à la détoxication de certains xénobiotiques, mais leur potentiel activateur peut aussi constituer, au moins localement au sein de certains tissus, une source d’apparition de métabolites toxiques. Ceux-ci sont en particulier capables de se fixer à des macromolécules (acides nucléiques, protéines) et d’altérer ainsi certaines fonctions cellulaires (Figure 12).
NAT2 et cancer du sein
Le sein est un autre tissu cible pour les composés cancérigènes entrant en contact avec le corps humain. Le cancer du sein est une maladie multifactorielle avec comme facteurs prédisposants la consommation de viande rouge et le tabagisme, entre autres [Williams et Phillips, 2000]. Les données épidémiologiques sur le cancer du sein ne lient pas directement le polymorphisme génétique de la NAT2 à cette maladie [Agündez et coll. 1995, Hunter et coll. 1997, Ambrosone et coll. 1998b, Gertig et coll. 1999, Matheson et coll. 2002, Lee et coll. 2003, Kocabas et coll. 2004, Van der Hel et coll. 2004]. Cependant, le phénotype acétyleur lent a été impliquée en tant que facteur marginal prédisposant du cancer du sein lorsque d’autres facteurs, tels que le tabagisme actif ou passif, la consommation excessive de viande rouge trop cuite ou la ménopause sont pris en compte [Ambrosone et coll. 1996, Millikan et coll. 1998, Huang et coll. 1999, Deitz et coll. 2000, Morabia et coll. 2000, Krajinovic et coll. 2001, Chang-Claude et coll. 2002].
En outre, l’activité enzymatique de la NAT2 semble être plus élevée dans les tissus mammaires malins que dans les tissus sains. Ces observations suggèrent que l’étude de la NAT2, en ce qui concerne le cancer du sein, devrait être effectuée à différents niveaux, depuis le génotype, jusqu’à l’efficacité catalytique en passant par la transcription, la traduction et la stabilité des protéines [Geylan et coll. 2001].
Beaucoup de travaux ont montré une association entre le tabagisme, l’alimentation et un risque plus élevé de cancer du sein chez les sujets acétyleurs lents pour la NAT2 [Ambrosone et coll. 1996, Huang et coll. 1999].
En dehors du profil d’acétylation de la NAT2, les sujets fumeurs et non fumeurs ont un même rapport de risque pour le cancer du sein. Donc le profil acétyleur lent de la NAT2 ralentit la capacité du corps à se débarrasser des amines aromatiques et des substances cancérigènes contenues dans la fumée de cigarette et favorise ainsi la formation d’adduits à l’ADN incriminés dans la genèse des cancers d’une manière générale [Pfau et coll. 1998, Stone et coll. 1998]. Des niveaux plus élevés d’adduits d’ADN ont été retrouvés dans les tissus mammaires des sujets acétyleurs lents que dans ceux des sujets acétyleurs rapides [Pfau et coll. 1998].
Cette association était plus marquée chez les patientes ménopausées. En effet, les acétyleurs lents ont un taux réduit de métabolisation des amines aromatiques et hétérocycliques, et chez ces individus, l’évolution des arylamines vers la voie d’hydroxylation qui forme des métabolites réactifs d’ADN est favorisée [Chang-Claude et coll. 2002, Dupret et Rodrigues-Lima 2005].
Néanmoins, Alberg et coll. 2004, ont montré que le génotype acétyleur rapide de la NAT2 est associé à un risque accru de carcinome mammaire en particulier chez les patientes ménopausées, indiquant que la NAT2 agissait davantage comme un activateur de procarcinogènes que comme un détoxifiant. Cette association doit être verifiée étant donné le très petit nombre d’homozygotes NAT2 acétyleurs rapides considérés et en plus, cette association n’a pas été observée dans d’autres études. Par exemple, dans les cas de cancer du sein chez des taïwanais, il a été constaté que le risque de cancer du sein n’a pas été significativement influencé par les polymorphismes de la NAT2 [Kuo et coll. 2007].
NAT2 et hépatotoxicité
Le rôle des enzymes de métabolisation des xénobiotiques dans la carcinogenèse hépatique est à prévoir chez les patients atteints d’un cancer du foie lié à l’environnement puisque, outre l’hépatite virale, le cancer du foie peut être lié à des substances environnementales. Les résultats obtenus chez les patients atteints d’un cancer primitif du foie non lié à l’hépatite virale sont cohérents et indiquent une association pertinente, du profil d’acétylation de la NAT2 et de la prédisposition au cancer du foie.
Le polymorphisme génétique de la NAT2 est surtout associé à l’hépatotoxicité médicamenteuse, car la NAT2 étant la principale enzyme impliquée dans le métabolisme de l’isoniazide, est exprimée au niveau du foie. La diminution ou la perturbation de l’activité de la NAT2 pourrait entraîner l’accumulation des précurseurs, tels que l’hydrazine et l’acétylhydrazine dans le foie, conduisant à l’hépatotoxicité de ce médicament [Timbrell 1979, Noda et coll. 1983, Lauterburg et coll. 1985].
Mais contrairement à la plupart des cancers, il y a eu très peu d’études qui ont exploré le rôle du profil d’acétylation de la NAT2 dans le processus de survenue du cancer du foie, en particulier dans celui de l’hépato-carcinome.
Trois allèles NAT2 acétyleurs lents sont principalement associés à l’hépatotoxicité de l’INH induite par l’enzyme NAT2 : NAT2*5B, NAT2*6AetNAT2*7B[Deguchi et coll. 1990, Cascorbi et col 1995, Gross et coll. 1999, Hein et coll. 2002, Huangh et coll. 2002, Sharma et coll. 2002].
Rodrigo et coll. 1999, ont démontré, en Espagne, que les acétyleurs lents avaient un risque faible de développer la cirrhose du foie induite par l’INH, même chez les sujets alcoolo-dépendants.
L’association entre le polymorphisme génétique de la NAT2 et le carcinome hépatocellulaire a été mise en évidence par Yu et coll. en 2000, mais uniquement chez des patients fumeurs et exposés à d’autres toxiques de l’environnement via l’alimentation et diagnostiqués acétyleurs rapides. En Asie, des études ont établi une association entre le phénotype acétyleur lent de la NAT2 et l’hépatotoxicité médicamenteuse des antituberculeux [Deguchi et coll. 1990], en particulier de l’INH chez des sujets Taïwanais, [Huang et coll. 2002 et 2003], indiens [Pande et coll. 1996, Hussain et coll. 2003] et japonais [Ohno et coll. 2000, Hiratsuka et coll. 2002, Shimizu et coll. 2006].
NAT2 et autres maladies
L’association entre le type d’acétylation et le risque d’autres maladies a été extensivement étudiée. Les deux modes d’acétylation (lent et rapide) paraissent jouer un rôle majeur dans l’augmentation du risque de développement de plusieurs maladies en plus des cancers [Gawronska-Szklarz et coll. 1999, Chan et coll. 2003].
Comme les composés chimiques présents dans le tabac sont inactivés par les enzymes de phase II, il a démontré que le risque de cancer du larynx peut être modifié par des variations du profil génétique de la NAT2. Mais, les résultats globaux indiquent qu’aucune association significative entre le polymorphisme de la NAT2 et le risque de cancer du larynx n’est à prévoir [Borlak et coll. 1994, Gajecka et coll. 2005]
En ce qui concerne le cancer du poumon, plusieurs études, fondées sur l’hypothèse que l’acétylation lente pourrait augmenter le risque de cancer du poumon, ont été menées. Cettehypothèse a été renforcée par des études indiquant que l’acétylation lente, surtout si elle est associée à un défaut de génotypes pour d’autres enzymes de phase II, peut conférer une susceptibilité accrue à la formation d’adduits au niveau des poumons. Mais les preuves actuelles suggèrent que le polymorphisme NAT2 seul ne constitue pas un facteur de risque pertinent dans le processus de survenue du cancer du poumon. Toutefois, ce polymorphismepeut renforcer l’effet d’autres facteurs génétiques et/ou de l’environnement [D’Errico et coll. 1999].
Extraction de l’ADN
La source majeure pour extraire de l’ADN est les globules blancs. A partir du sang total, l’ADN génomique a été extrait à l’aide de deux kits selon les instructions du fournisseur : Nucléon BACC3 ND (Amersham Pharma Biotech, saclay, France) et NucléonSpin ND (Macherey-Nagel Eurl, France). Le kit NucléoSpin ND a été utilisé pour les échantillons de faible volume (200µl -2mL) et le kit Nucléon BACC3 ND pour les échantillons de volume plus important (à partir de 5mL).
Les différentes phases d’une extraction d’ADN sont respectées c’est-à-dire la lyse cellulaire pour faire éclater les globules rouges avec une solution détergente, la déprotéinisation avec la protéinase K ou le perchlorate de sodium (selon les kits), l’extraction de l’ADN par le chloroforme et sa précipitation par l’éthanol.
Contrôle qualitatif et quantitatif des ADN
Les concentrations des différents extraits d’ADN ont été déterminées par mesure de l’absorbance à une longueur d’onde de 260 nm et aussi de 280 nm, à l’aide d’unspectrophotomètre. En effet, les acides nucléiques absorbent aussi bien à 260 nm qu’à 280 nm mais ont un spectre d’absorption maximum en UV à 260 nm. Cette absorption est proportionnelle à la concentration de l’ADN ; une densité optique de 1 à 260 nm correspond à une concentration de 50 µg/mL d’ADN double brin. Un spectromètre Nanodrop ND (thermoScientific, Courtaboeuf, France) a été utilisé. La pureté de l’ADN a été déterminée par le rapport de la densité optique à 260 nm et aussi à 280 nm (DO 260 /DO 280 nm) et ce rapport doit être compris entre 1.8 et 2,0 afin de pouvoir considérer l’ADN débarrassé des protéinescellulaires donc pur. D’autres part la mesure de la DO à 270 nm et le calcul du rapport DO260 nm / DO 270 nm est effectué pour s’assurer que la solution contient peu ou pas d’alcool résiduel. Ce rapport d’absorption doit être inférieur à 1. Le logiciel fournit directement la concentration d’ADN en ng/µL. Ensuite les échantillons d’ADN sont gardés à +4°C jusqu’à la réalisation des techniques de PCR et de Séquençage.
|
Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
I. GENERALITES SUR LES N-ACETYLTRANSFERASES
1.1. Historique et évolution des données sur les NATs
1.2. Localisation, expression et structure des NAT
1.3. Principales fonctions des N-Acétyltransfèrases
1.4. Déterminisme génétique de la N-Acétyltransférases de type 2 (NAT2)
1.5. Méthodes de détermination du polymorphisme génétique de la NAT2
1.5.1. Le phénotypage
1.5.2. Le génotypage
1.6. Association du polymorphisme génétique de la NAT2 avec des pathologies
1.6.1. NAT2 et cancer de la vessie
1.6.2. NAT2 et cancer colorectal
1.6.3. NAT2 et cancer du sein
1.6.4. NAT2 et hépatotoxicité
1.6.5. NAT2 et autres maladies
II. MESURE DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE DE LA NACETYLTRANSFERASE DE TYPE 2 DANS LA POPULATION SENEGALAISE
2.1. Matériels et Méthodes
2.1.1. Population d’étude et échantillonnage urinaire
2.1.2. Validation de la méthode CLHP de dosage des métabolites de la caféine
2.2. Article 1 : « Détermination du polymorphisme d’acétylation de la NAcétyltransférase 2 dans la population sénégalaise par HPLC : utilisation du rapport [AFMU/IX] pour évaluer l’activité enzymatique de la NAT2 »
III. RECHERCHE DE MUTATIONS DU GENE DE LA NACETYLTRANSFERASE DE TYPE 2 DANS LA POPULATION SENEGALAISE PAR PCR-SEQUENÇAGE
3.1. Echantillons d’ADN analysés
3.2. Extraction de l’ADN
3.3. Contrôle qualitatif et quantitatif des ADN
3.4. Amplification par PCR et étude des mutations par séquençage
3.4.1. Amplification du fragment à séquencer
3.4.2. Analyse des amplicons par électrophorèse sur gel d’agarose
3.4.3. Purification enzymatique des amplicons
3.4.4. Extension des amplicons après marquage
3.4.5. Séquençage sur 3130 XL 16 capillaires (Applied Biosystems)
3.5. Analyse in silico
3.6. Résultats
3.7. Corrélation génotype-phénotype
3.8. Discussion
3.9. Article 2: « Study of NAT2 genetic polymorphism in West African subjects: example of an healthy non-smoker Senegalese population”
IV. ETUDE DE LA CINETIQUE DE L’INH CHEZ LES PATIENTS ATTEINTS DE TUBERCULOSE
4.1. Recrutement de patients atteints de tuberculose et échantillonnage de sang hépariné
4.2. Méthodes analytiques
4.2.1. Principe de la chromatographie et de la spectrométrie de masse
4.2.2. Appareillage
4.2.3. Réactifs
4.2.4. Méthode analytique
4.2.5. Calcul de l’indice d’acétylation
4.3. Résultats
4.4. Corrélation polymorphisme génétique de la NAT2 – cinétique de l’INH
4.5. Discussion
4.6. Article 3 : Génotypage de la NAT2 chez des sujets sénégalais atteints de tuberculose:corrélation avec la cinétique de l’INH : en rédaction
DISCUSSION GENERALE
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
