Recherche contemporaine de nouveaux facteurs de risque génétique de la MTEV

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Physiopathologie de la MTEV

La physiopathologie des thromboses (veineuses ou artérielles), décrite dès 1856 par Virchow, repose sur trois éléments connus sous le nom de « triade de Virchow ». La formation d’une thrombose est favorisée par (1) une modification du flux sanguin, pouvant être soit une stase, soit une turbulence locale ; (2) un traumatisme de la paroi vasculaire ; (3) une modification de la composition sanguine perturbant l’équilibre entre la coagulation, l’anticoagulation et la fibrinolyse, à l’origine d’une hypercoagulabilité, encore appelée thrombophilie.
La formation du complexe TF-VIIa – à l’origine de la cascade de la coagulation – ne fait pas seulement suite à une brèche vasculaire, comme nous venons de le décrire au §I.3. Au contraire, le plus souvent, le TF provient d’une activation de l’endothélium, conséquence d’une inflammation. L’endothélium libère des granules contenant du vWF et de la P-selectin. Ces protéines ont la capacité de recruter des leucocytes, dont certains (les monocytes, particulièrement) sécrètent du TF. La stase veineuse induit également une activation de l’endothélium, en favorisant une hypoxie par désaturation des globules rouges en hémoglobine. De plus, elle favorise l’accumulation de facteurs prothrombotiques. En effet, la baisse de flux sanguin diminue l’acheminement de la thrombine vers son principal lieu de désactivation, le lit capillaire pulmonaire, tapissé de thrombomoduline. Enfin, elle ne favorise pas le déploiement de la molécule du vWF, et rend ainsi peu accessible les sites de clivages par la protéase ADAMTS13.
La MTEV survient lors de situations favorisant un ou plusieurs éléments de la triade de Virchow. La section suivante en présente les principaux facteurs de risque.

Etiologie de la MTEV

La MTEV est une maladie multifactorielle (ou « complexe »): ses facteurs de risque sont à la fois génétique et environnementaux (au sens large du terme, soit tout ce qui n’est pas génétique). Différentes études, réalisées à partir d’échantillons composés soit de paires de jumeaux [14], soit de familles plus élargies [15][16], ont estimé l’héritabilité de la MTEV (i.e la part du rôle des facteurs génétiques dans la survenue d’une MTEV, voir annexe « les différents types d’études épidémio-génétiques », pA3). Selon ces études, l’héritabilité varie entre 55% et 62%. De plus, une étude de ségrégation (voir annexe pA3) conduite sur l’un de ces échantillons [16], conclut que le mode de transmission de la MTEV est concordant avec un modèle multigénique impliquant de nombreux gènes aux effets modestes.
Dans ce paragraphe consacré à l’étiologie de la MTEV, nous présenterons d’abord les facteurs de risque de MTEV dits « démographique » (ie le sexe, l’âge et l’origine ethnique). Nous verrons ensuite les facteurs de risque acquis, c’est-à-dire toute circonstance dans la vie d’un patient ayant pu favoriser la survenue d’une thrombose. Nous terminerons enfin par un exposé des facteurs de risque génétiques connus actuellement.

Facteurs démographiques : sexe, âge, ethnie

L’incidence de la MTEV est peu différente entre les hommes et les femmes d’après la plupart des études (revues dans [5]). Si certaines études notent un risque légèrement plus élevé de MTEV chez les femmes jeunes par rapport aux hommes du même âge (vraisemblablement en raison de grossesses ou de la prise de contraception orale) [3], cette tendance s’inverse après 40 ans [3][4][17]. En revanche, l’incidence de la MTEV augmente avec l’âge de manière exponentielle, particulièrement après 40 ans. Elle est estimée à 0.3‰ par an et par personne entre 25 et 35 ans, et s’élève entre 3 et 5‰ par an et par personne entre 70 et 79 ans[2][3][1][17]. Cependant, bien que de nombreuses études corroborent ce résultat, aucune ne fournit d’explication physiopathologique permettant d’en expliquer l’ampleur. Plusieurs facteurs participent probablement à ce phénomène : une baisse de la mobilité des personnes âgées, une augmentation de la prévalence de pathologies induisant de forts risques de MTEV, une dégradation des valves veineuses affectant ainsi le retour du sang vers le cœur.
L’incidence de la MTEV varie de façon importante suivant l’ethnie. D’après une étude californienne incluant des sujets de différentes origines, les personnes d’origine hispanique et asiatique ont une incidence de MTEV respectivement 1.67 et 3.70 fois moindre que les personnes d’origine caucasienne, tandis qu’elle est 1.27 fois plus élevées chez les personnes d’origine africaine [18]. Si des raisons socio-économiques ont pu être avancées, elles n’ont pas permis d’expliquer cette diversité. Il semblerait en revanche qu’elle soit la conséquence de facteurs génétiques, dont la fréquence dépend de l’origine ethnique. Par exemple, la mutation du facteur V Leiden, responsable d’une augmentation du risque de survenue de MTEV (voir §II.3.2 p13), n’est présente que chez 0,5% de la population asiatique, contre près de 5% de la population caucasienne [19][20]. Cependant, la fréquence de la mutation Facteur V Leiden observée chez les américains d’origine africaine est du même ordre de grandeur que celle observée chez leurs concitoyens d’origine asiatique. D’autres facteurs génétiques sont donc vraisemblablement à l’origine des inégalités observées entre les prévalences de la MTEV de ces deux populations [19][21].

Facteurs de risque acquis

Contrairement à la thrombose artérielle qui fait suite à une longue évolution de maladie inflammatoire des artères (l’artériosclérose), la MTEV survient de façon brutale sur des veines saines. Dans environ la moitié des cas, elle se déclare à la suite d’un événement déclenchant facilement identifiable:
– Les traumatismes et les opérations chirurgicales induisent un fort risque de survenue de MTEV. En particulier, en absence de prophylaxie, la chirurgie orthopédique peut provoquer dans 30% à 50% des cas une MTEV [22][23]. Les poly-traumatisés ont 50 à 60% de risque de développer une MTEV [24]. Les chirurgies abdominales et pelviennes ne sont pas non plus dénuées de risque (environ 30%) [25][26][27]. La plupart de ces événements est heureusement désormais évitée par un traitement anticoagulant préventif. Cependant, malgré la diffusion en pratique courante hospitalière de la prophylaxie antithrombotique, on observe encore 1% à 3% de MTEV dans les suites d’une pose de prothèse de hanche ou de genou. Le risque de MTEV est multiplié environ par 4 en cas d’opération chirurgicale majeure (revu dans [28]).
– Toute situation engendrant une immobilisation, en favorisant la stase veineuse, provoque une augmentation du risque de survenue de MTEV : l’immobilisation d’un membre dans un plâtre, le confinement au lit ou au fauteuil, ou encore devant un écran d’ordinateur à rédiger son mémoire de thèse (phénomène récent, connu sous le nom de « eThrombosis » [29]), par exemple… A ce titre, les longs trajets en avion sont à haut risque de MTEV [30][31]. De surcroît, l’hypoxie hypobare induite par l’altitude pourrait occasionner une activation de la coagulation, quoique ce phénomène soit encore débattu. Il ne pourrait concerner que les personnes présentant d’autres facteurs de thrombophilie, en particulier constitutionnelle, ou induite par la prise de contraception orale [32].
– Les cancers sont associés à une augmentation du risque de MTEV, d’après une étude cas-témoins récente incluant 3220 MTEV et 2131 témoins. Le risque est augmenté d’environ 7 fois, tout cancer confondu. Les néoplasies les plus à risques sont les hémopathies, suivies des cancers du poumon et de l’estomac [33]. Une étude longitudinale de 537 patients atteints d’un cancer du poumon a montré que le risque de MTEV était environ 20 fois supérieur à celui de la population générale. Parmi ces patients, ceux qui présentaient un adénocarcinome avaient 3 fois plus de risque que ceux qui présentaient un cancer à petites cellules [34]. Les mécanismes incriminés sont multiples : si la baisse de la mobilité consécutive à la maladie ou encore une compression veineuse par la tumeur elle-même sont des raisons évidentes, on invoque également une augmentation de la thrombophilie due à la libération de facteurs pro-coagulant, tel le TF, par la néoplasie [35]. La iatrogénie est également mise en cause. Plus de 10% des patients développent une MTEV au niveau d’un cathéter veineux central [36]. Par ailleurs, certaines chimiothérapies ont des effets thrombogéniques [37].
– Les hormones féminines, et plus particulièrement les dérivés oestrogèniques utilisés pour la contraception orale, augmentent l’activité coagulante du sang. En effet, métabolisées dans le foie, elles interagissent avec la plupart des facteurs de la coagulation synthétisés dans le foie. Ainsi, la contraception orale, qui associe des dérivés de l’œstrogène et de la progestérone, augmente d’environ quatre fois le risque de MTEV (revu dans [28]). D’un côté, l’incidence de la MTEV étant très faible chez les femmes jeunes, le risque absolu de MTEV reste également faible chez les utilisatrices de contraception orale. Mais de l’autre côté, la contraception orale étant largement prescrite chez les femmes jeunes, l’impact en termes de santé publique n’est pas négligeable. Le traitement hormonal substitutif est quant à lui associé à une augmentation de 2 à 4 fois du risque de MTEV (revu dans [28]).

Les mutations de facteurs de la coagulation : mutation du Facteur V de Leiden (FVL), et mutation du Facteur II G20210A (mutation du gène de la prothrombine)

Le premier cas familial de résistance à la protéine C activée (APCR) a été découvert en 1994 : une mutation du Facteur V (connue sous le nom de Leiden) altère son affinité avec la protéine C, et par là sa désactivation par cette dernière [55]. La présence de cette mutation à l’état hétérozygote augmente le risque de MTEV de trois à cinq fois, et jusqu’à 50 à 80 fois, à l’état homozygote [56][57]. Cette mutation n’est pas rare dans la population caucasienne : sa fréquence est aux alentours de 5%. Dix à vingt pour cent des patients atteints de MTEV présentent cette mutation, tandis qu’environ 90% des porteurs hétérozygotes de cette mutation ne développeront jamais, au cours de leur vie, de MTEV[58]. Ainsi, la valeur prédictive de la mutation FVL est limitée.
La découverte de cette mutation, fréquente et à faible pénétrance, permit de considérer la MTEV comme une maladie complexe, et d’envisager d’autres stratégies de découverte de nouveaux gènes de susceptibilité. C’est ainsi qu’en 1996, une étude cas-témoins mit en évidence, grâce au séquençage de l’ensemble du gène du Facteur II, une mutation dans la région régulatrice 3’ de ce dernier (mutation du Facteur II G20210A). Il s’agit d’une mutation « gain-de-fonction », induisant une augmentation de la reconnaissance du site de clivage, à l’origine d’une augmentation de la production de mRNA et par conséquent de synthèse de prothrombine. Cette mutation, présente dans 2 à 3% de la population générale, induit une augmentation des taux plasmatiques de Facteur II, et un risque de MTEV environ trois fois supérieur à celui de la population générale [59].

Le groupe sanguin ABO

Le groupe sanguin ABO est un phénotype déterminé par la présence de résidus sucrés à la surface des grobules rouges. La variabilité d’un individu à l’autre de ces résidus est induite par la présence de polymorphismes dans le gène ABO. Dès la fin des années 60, Jick et al observèrent, dans le cadre d’un programme nord-américain de surveillance pharmacologique, une sous-représentation de patients du groupe O parmi ceux traités pour une MTEV par un anticoagulant [60]. Selon une méta-analyse récente incluant 21 études prospectives ou rétropectives totalisant 6 720 patients [61], l’OR de MTEV des personnes des groupes A, B ou AB, par rapport aux personnes du groupe O, était de 1,79 (avec un intervalle de confiance à 95%, IC95, compris entre 1,56 et 2,05). De plus, trois de ces études étudiaient les génotypes du gène ABO et distinguaient les allèles A1 et A2. Prenant comme référence les génotypes OO/OA2/A2A2, l’OR de MTEV des génotypes A1O/BO/A2B était 2,11 (IC95 [1,66-2,68]). Quant à celui des génotypes A1A1/A1B/BB, il était de 2,44 (IC95 [1,79-3,33]. Les risques de MTEV associés aux génotypes A1O/BO/A2B et A1A1/A1B/BB n’étaient pas significativement différents. Les personnes du groupe O présentent, dans de nombreuses études revues dans [62], des taux de vWF plus faibles d’environ 25% que les personnes des groupes A, B ou AB. C’est certainement la principale raison pour laquelle les personnes du groupe O sont moins exposées au risque de MTEV. Nous reviendrons au §IV.3.1.1 p24 sur les mécanismes biologiques reliant ABO, vWF et FVIII.
Les mutations génétiques engendrant une augmentation du risque de survenue de MTEV (déficits en inhibiteurs de la coagulation et mutations des gènes du FV et FII) ne sont retrouvées que dans ~30% des cas de MTEV (rev dans [63]). Parmi ces mutations, la mutation FVL présente le plus grand risque attribuable (14%) en raison de sa relative fréquence dans la population. Les groupes sanguins non-O ont, quant à eux, un risque attribuable de près de 30%. Le risque attribuable conjoint des mutations des gènes des FII et FV et des polymorphismes d’ABO s’élève à 40% d’après une étude récente [64]. Il est ainsi couramment admis qu’une part importante des facteurs de prédisposition génétique reste à découvrir.

Recherche contemporaine de nouveaux facteurs de risque génétique de la MTEV

Alors que les premiers facteurs de risque génétiques de MTEV découverts étaient à la fois extrêmement rares et à haut risque de MTEV, la recherche de nouveaux facteurs de risque génétiques s’oriente vers la découverte de polymorphismes plus fréquents et conférant des risques de MTEV de plus en plus faibles. On distingue deux approches stratégiques pour la découverte de nouveaux gènes de susceptibilité. La première, l’approche « gènes candidats » consiste à tester des hypothèses a priori issues de connaissances antérieures concernant les fonctions des gènes. Si elle peut se révéler efficace dans la découverte de nouveaux polymorphismes associés à la maladie, elle ne permet pas de mettre en lumière de nouvelles voies physiopathologiques. Au contraire, la deuxième approche, dite « genome-wide » ou pangénomique, balaie indistinctement l’ensemble du génome sans considération biologique.
Il existe en épidémiologie génétique deux méthodes d’analyse de données issues du génotypage de marqueurs : les analyses de liaison et d’association (voir annexe pA2 et A3).
Les analyses de liaison cherchent à localiser sur le génome le(s) gène(s) influençant le phénotype à l’étude. Pour cela, elles étudient la co-transmission d’un parent à son enfant du gène – dont on cherche la position – et des marqueurs génétiques – de position connue. Si un marqueur et le(s) polymorphisme(s) de susceptibilité sont proches, ils sont transmis ensemble, plus souvent que ne le voudrait le hasard. Ainsi, des frères dont les phénotypes sont identiques partagent, pour tout marqueur proche du gène, une plus grande proportion d’allèles identiques que ne le voudraient les lois de transmission mendéliennes. On parle d’allèles identiques par descendance (par opposition à des allèles identiques par état), car ce qui importe ici n’est pas tant que les frères présentent les mêmes formes alléliques pour le marqueur, mais que le parent qui leur a transmis l’allèle responsable de leur phénotype commun leur ait également transmis à l’un et l’autre le même allèle marqueur ancestral.
De façon succincte, les analyses de liaison, fondées sur l’observation des transmissions alléliques, nécessitent un échantillon familial. On observe un phénomène de liaison lorsque des apparentés de phénotype similaire présentent des allèles identiques par descendance en proportion plus grande que ne le voudrait le hasard des transmissions. D’une famille à l’autre, la forme allélique liée aux phénotypes peut tout à fait différer (mais pas au sein d’une même famille). Le marqueur lié au phénotype n’est pas responsable de la variabilité phénotypique observée. Il est simplement localisé à proximité du gène (ou de l’un des gènes) impliqué(s). Les études de liaison mettent en évidence des régions chromosomiques d’intérêt, longues en général de quelques megabases, ou dizaines de megabases, et qui incluent plusieurs dizaines, ou quelques centaines de gènes. Les analyses d’association, quant à elles, cherchent à identifier le ou les polymorphismes dont les différentes formes alléliques participent à la variabilité du phénotype. En cas d’association avec un marqueur, la probabilité de présenter un phénotype particulier dépend des allèles présentés par ce marqueur. Les études d’association se réalisent aisément en population générale, les études cas-témoins étant particulièrement adaptées aux études d’association d’un phénotype binaire. Il est cependant possible de réaliser des analyses d’association au sein d’échantillons familiaux au moyen d’une méthodologie idoine. Les études d’association sont plus précises que les analyses de liaison. Pour autant, l’association entre un marqueur et le phénotype ne signe pas nécessairement une relation de causalité (on parle alors de polymorphisme « fonctionnel »), mais seulement un déséquilibre de liaison (voir annexe pA5) entre le marqueur et le polymorphisme fonctionnel.
Les analyses de liaison et d’association sont en théorie toutes deux applicables tant aux approches de génération d’hypothèses (pangénomiques), qu’à celles testant des hypothèses sur des gènes-candidats. Cependant, jusqu’à la fin du XXème siècle, les limites techniques ne permettaient pas d’effectuer des études d’association pangénomiques. Les études pangénomiques étaient des analyses de liaison, réalisées au moyen de quelques centaines de microsatellites criblant l’intégralité du génome. Les régions candidates ainsi mises en évidence faisaient ensuite l’objet d’une cartographie plus fine, grâce à un un maillage génotypique plus serré au moyen de polymorphismes bialléliques (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) en vue de réaliser des analyses d’association.
Les avancées technologiques du début du XXIème siècle permirent de réaliser, au moyen de biopuces, un génotypage à très haut débit de plusieurs centaines de milliers de SNPs couvrant l’intégralité du génome. La conception de ces biopuces s’appuya sur les connaissances fondamentales apportées par le projet HapMap. Celui-ci entreprit de cataloguer les quelques 10 millions de SNPs identifiés par le séquençage du génome, et de mesurer le déséquilibre de liaison entre ces SNPs. Cette connaissance permet un génotypage optimal, qui couvre plus de 90% de la variabilité et évite toute redondance d’information. Il est désormais possible, grâce à ces puces, de balayer l’ensemble du génome à la recherche de signaux d’association.

Approche gène candidat

La recherche de facteurs de risque génétiques de MTEV par une approche gène candidat est à l’origine d’une littérature abondante. Les résultats les plus robustes, confirmés par des études ultérieures et des arguments fonctionnels, ont été obtenus par l’étude de polymorphismes du gène du fibrinogène γ [65]. Le SNP rs2066865 influence le risque de MTEV, vraisemblablement en modifiant l’efficacité de l’épissage alternatif à l’origine de la formation du fibrinogène γ’. Nous avons vu §I.3.2.2 p6 et tableau 1 p7 que cet épissage crée un site de capture de la thrombine, crucial pour le contrôle de l’amplification de la formation de celle-ci.
Les résultats des autres études de gènes candidats ne semblent pas aussi robustes. L’étude la plus complète, au moment où je commençais ce travail, était certainement celle menée par Smith et al.[66] qui étudiaient les polymorphismes de 24 gènes codant pour des protéines intervenant dans la coagulation, l’anticoagulation, la fibrinolyse et l’antifibrinolyse. D’autres études sont parues depuis, examinant un nombre toujours plus grands de gènes. Chaque étude observe de nombreuses et nouvelles associations sans nécessairement reproduire les résultats précédents [67][64]. Cependant, plusieurs gènes présentant des polymorphismes associés à la MTEV sont communs aux trois études, bien que ces polymorphismes soient différents. Il s’agit des gènes du FII, du FV, du FXI, du fibrinogène α et de la PC.

Analyse de liaison suivie d’association au sein de régions candidates

Une seule étude de liaison pangénomique sur la MTEV a été publiée. Elle a été réalisée chez une unique famille franco-canadienne de 289 membres, sur quatre générations, dont 28 avaient présenté une MTEV. Un déficit en protéine C ségrégeait dans cette famille, mais n’expliquait que partiellement les cas de MTEV. L’analyse de liaison avait donc pour but de mettre en évidence la présence de gène(s) expliquant la pénétrance incomplète et la phénocopie de la mutation dans cette famille. Outre la région de la Protéine C, l’analyse a décelé trois régions liées à la MTEV, en 10p12, 11q23 et 18p11 [68]. Après avoir séquencé 109 gènes localisés au sein de ces régions et décelé près de 500 polymorphismes, les auteurs ont mis en évidence une association entre la MTEV et des SNPs de CADM1 (p<10-5), gène à l’origine d’une protéine intervenant dans la migration des cellules endothéliales[69]. A notre connaissance, ce résultat n’a pas été reproduit.

Les études d’association génome-entier (GWAS en anglais)

Un premier pas vers les GWAS fut réalisé par une étude qui analysait environ 20 000 SNPs situés dans 10 000 gènes [70]. Les SNPs étaient sélectionnés sur un critère de fonctionnalité : seuls avaient été génotypés les SNPs non synonymes -qui induisent une modification d’acide aminé dans la protéine- ou situés dans le promoteur du gène et susceptibles de provoquer une modification dans la quantité du gène exprimé. Les auteurs ont adopté une stratégie en trois étapes, afin de se prémunir des fausses découvertes liées aux tests multiples. Les fréquences alléliques de l’ensemble des SNPs ont d’abord été comparées chez 443 cas et 453 témoins. Dans une seconde étape, 1206 SNPs présentant des associations significatives (p<0,05) avec la MTEV ont été étudiés dans un échantillon indépendant de 1398 cas et 1757 témoins. Enfin, parmi les dix-huit associations répliquées, neuf ont fait l’objet d’une troisième analyse chez 1314 cas et 2877 témoins. Au terme de ces trois étapes, trois SNPs étaient associés au risque de MTEV. Deux d’entre eux étaient situés dans des gènes dont la fonction est directement liée à l’hémostase. Ils étaient situés dans les gènes SERPINC1 (gène de l’anti-thrombine), et GP6 (gène codant pour une glycoprotéine qui est présente à la surface des plaquettes et joue un rôle dans l’activation et l’agrégation des plaquettes). Quant au troisième, il était situé dans le gène CYP4V2, lui-même proche du gène F11 (codant pour le facteur XI). Les OR de ces SNPs étaient estimés à 1,24 IC95 [1,11-1,37] pour CYP4V2-rs13146272, 1,29 IC95 [1.10-1.49] pour SERPINC1-rs2227589 et 1,15 IC95 [1,01-1,30] pour GP6-rs1613662.
La première véritable GWAS sur la MTEV a été réalisée par l’équipe de David Trégouët en collaboration avec le groupe du Professeur Pierre-Emmanuel Morange (Hopital de la Timone, Marseille). Elle incluait 419 patients de moins 50 ans et 1228 témoins chez lesquels un panel d’environ 300 000 SNPs a été génotypé [71]. Les seules associations dont la significativité était inférieure à p=1.7 10-7 (correspondant à la correction de Bonferroni pour test multiples, voir annexe pA7) étaient situées dans les gènes déjà connus F5 et ABO. L’étude avait une puissance proche de 100% de déceler toute association du même ordre que celle obtenue avec les polymorphismes d’ABO (OR=1,9 et fréquence de l’allèle mineur (MAF) proche de 0,5), à condition bien sûr que le polymorphisme fonctionnel fût en déséquilibre de liaison suffisamment fort avec l’un des SNPs du panel génotypé (voir annexe «déséquilibre de liaison» pA5). La puissance valait un peu plus de 60% pour déceler des associations du même ordre que celle obtenue pour les SNPs de F5 (OR=2,3 ; MAF<0,10). Elle était ainsi insuffisante pour détecter de faibles effets, à l’instar de ceux habituellement trouvés dans les études GWAS. En comparaison, une GWAS portant sur la maladie coronaire avait inclus près de 90 000 individus, auxquels s’ajoutaient 50 000 individus pour l’étude de réplication, afin de pouvoir déceler des OR d’environ 1.12 [72].
NB : Les résultats de cette étude étaient connus et en voie de publication au moment où j’entreprenais ce travail. A plusieurs reprises, j’ai consulté ces résultats à la recherche d’associations observées dans certaines régions du génome, ou encore pour quelques SNPs particuliers. Ces recherches seront désignées dans ce document par le terme « in silico ».
Ainsi, à l’instar de toute maladie complexe, la MTEV possède de multiples facteurs de risques. Considérés individuellement, ceux-ci modifient de manière minime la susceptibilité à la maladie. Les analyses de liaison sont peu adaptées à leur découverte. En effet, l’hétérogénéité génétique réduit la puissance de découverte en cas d’échantillon multifamilial. D’un autre côté, la découverte d’un gène de susceptibilité dans un unique et grand pedigree est excessivement difficile à reproduire. Les analyses d’association (GWAS), quant à elles, paraissent plus adaptées à la recherche de facteurs multiples. Cependant, les effets qu’elles visent à découvrir sont généralement faibles et nécessitent des échantillons de très grande taille pour pouvoir les détecter et ensuite les valider dans des cohortes indépendantes.

Etude de phénotypes intermédiaires de la MTEV

La susceptibilité à la MTEV peut être vue comme un phénomène quantitatif si l’on considère que la MTEV est la conséquence de modifications quantitatives de divers facteurs physiologiques. Il peut s’agir soit d’une modification pathologique, comme dans le cas par exemple d’un déficit en protéine C, soit de légères modifications qui restent dans des fourchettes de variation normales mais dont l’accumulation est à l’origine d’une augmentation de risque de MTEV. Plusieurs protéines plasmatiques ont été ainsi trouvées associées au risque de survenue de MTEV (voir §III.4.2 ci-après) ; les taux plasmatiques de ces protéines sont alors communément appelés des phénotypes intermédiaires de la MTEV.
La recherche de gènes intervenant dans la variabilité de phénotypes intermédiaires permet d’augmenter la puissance de détection de nouveaux gènes de susceptibilité à la MTEV. En individualisant les différents phénotypes intermédiaires, on réduit considérablement l’hétérogénéité génétique. En effet, on s’attend à ce que le nombre de gènes qui contrôlent chaque phénotype intermédiaire soit très inférieur à ceux qui contrôlent la susceptibilité à la MTEV. Par ailleurs, les phénotypes intermédiaires sont plus proches de l’action du gène que ne l’est la maladie elle-même. L’effet du gène sera donc moins atténué induisant ainsi une puissance statistique plus importante pour le détecter. Un autre avantage de l’étude des phénotypes intermédiaires est qu’il peut être étudié avant l’apparition de la maladie. Enfin, elle permet de mieux individualiser les différents mécanismes physiopathologiques sous-jacents.
La première étape vers la détection de nouveaux gènes de susceptibilité à la MTEV consiste à identifier de bons phénotypes intermédiaires, en recherchant les facteurs biologiques dont les taux plasmatiques sont associés au risque de survenue de MTEV, puis en étudiant leur héritabilité. Cette recherche est à l’origine de nombreuses études dont nous proposons un aperçu.

Taux plasmatiques de facteurs biologiques associés à la MTEV

Les taux plasmatiques des protéines intervenant dans la cascade de la coagulation et de la fibrinolyse sont tout naturellement candidats pour faire partie de la liste des phénotypes intermédiaires de la MTEV. De nombreuses études ont étudié l’association entre ces taux plasmatiques et le risque de MTEV. De manière succincte, nous présentons ici les principaux facteurs dont l’association avec le risque de MTEV est désormais bien établie. Nous reviendrons plus en détail, au §IV.2 p23, sur l’association entre la MTEV et les deux facteurs qui font l’objet de mon travail de thèse, le FVIII, et sa protéine de transport, le vWF.
Les facteurs procoagulants dont les associations avec la MTEV sont les plus convaincantes sont le FVIII (OR du dernier quartile versus le permier quartile = 4,8), le FIX (OR du 90ème percentile = 2,5) et le FXI (OR du 90ème percentile = 2,2), d’après l’étude LETS qui incluaient entre 300 et 500 témoins et autant de cas suivant l’avancée du recrutement [73][74][75]. Les effets des autres facteurs, s’ils existent, sont plus difficiles à mettre en lumière (rev. dans [76]). Concernant les facteurs anticoagulants, les taux d’Inhibiteur de la Voie du Facteur Tissulaire (TFPI) inférieurs au dixième percentile sont associés à une augmentation du risque de MTEV de 1,7 fois d’après le projet LETS [77]. Enfin, pour les facteurs intervenant dans la fibrinolyse, nous retiendrons une augmentation du risque de MTEV (OR=1,7) chez les personnes présentant des taux d’Inhibiteur de la Fibrinolyse Activable par la Thrombine (TAFI) au-delà du 90ème percentile [78]. Nous avons déjà évoqué, lors de la présentation du syndrome métabolique, le rôle potentiellement thrombogène d’une augmentation du PAI-1, quoique celui-ci soit moins clairement objectivé que ceux des facteurs précédents (voir §II.2 p12).

Héritabilité des phénotypes intermédiaires de la MTEV

Les traits quantitatifs (TQs) associés à la MTEV ont un déterminisme à la fois environnemental et génétique, dans des proportions variables. Seuls ceux dont le déterminisme génétique est important sont de bons phénotypes intermédiaires de MTEV. Au moment où je commençais ma thèse, une nouvelle ère démarrait, au cours de laquelle la recherche de nouveaux facteurs génétiques de MTEV via l’étude de ses phénotypes intermédiaires se fit plus systématique. Elle fut préparée par la GAIT Study qui, en estimant l’héritabilité de 27 traits quantitatifs associés, ou susceptibles d’être associés, à la MTEV permit de choisir les phénotypes intermédiaires les plus prometteurs [82]. L’héritabilité est la part de la variabilité expliquée par des facteurs génétiques. La GAIT Study est une étude familiale, incluant 21 grandes familles espagnoles dont 12 étaient recrutées via un cas de thrombophilie idiopathique. Les résultats sont rapportés dans le tableau 2. Les estimations d’héritabilité, plus encore que toute estimation statistique, n’ont qu’une valeur indicatrice. Elles peuvent être surestimées en cas de recrutement particulier, ou encore en présence d’un environnement partagé par l’ensemble de la famille et mimant une ségrégation mendelienne. Elles seraient à l’inverse sous-estimées en cas de mauvaise modélisation des effets génétiques (voir §VI.2.1). Les héritabilités des FVIII et vWF, par exemple, ont été estimées à 40% et 32% dans la GAIT, alors qu’ils s’élevaient à 61% et 75% dans une grande étude de jumeaux, incluant 149 paires de monozygotes et 352 paires de dizygotes[83].

Etat des connaissances sur le sujet de cette thèse

Au moment où j’entreprenais ce travail, plusieurs études avaient déjà permis d’identifier divers facteurs génétiques influençant les taux de FVIII et/ou vWF, par des approches « gènes candidats » ou pangénomiques. Hormis les associations avec le gène ABO, les résultats n’étaient pas toujours reproductibles. Peu d’études avaient étudié la répercussion de ces facteurs génétiques sur le risque de survenue de MTEV.

Association entre le gène ABO (chromosome 9q34) et les taux de FVIII et vWF

Le gène ABO code pour une galactosyltransferase. Cette protéine participe à la maturation post-traductionnelle en ajoutant des sucres complexes sur des protéines. On retrouve ces complexes sur la membrane des globules rouges, des plaquettes, de cellules épithéliales et endothéliales. On connaît trois protéines plasmatiques concernées par cette maturation post-traductionnelle : le vWF, le FVIII et l’α2-macroglobuline. Les polymorphismes du gène ABO, à l’origine du sérogroupe ABO, détermine le type d’oligosaccharides (appelés A, B ou H) ajoutés aux protéines.
Les allèles A1 et B du gène ABO induisent une augmentation des taux de vWF et FVIII d’environ 20 à 30% par rapport aux allèles O et A2. (rev dans [62];[84]). Le mécanisme par lequel le groupe ABO influence les taux de vWF et FVIII est partiellement élucidé. La présence de l’oligosaccharide H (groupe O) favorise le clivage de vWF par ADAMTS13, et, par ailleurs, une plus forte clearance hépatique de vWF (rev dans [62]). L’association entre ABO et FVIII est au moins en partie expliquée par le rôle protecteur de vWF vis-à-vis de FVIII. Cependant, cette association reste significative après ajustement sur vWF ([84]). Une action du groupe ABO sur FVIII indépendamment de vWF est confortée par la présence de résidus A, B ou H sur FVIII. Cependant, contrairement à ce qui a pu être observé pour vWF, il semblerait que le type de résidu porté par FVIII n’ait aucune inflence sur la clairance de ce dernier. Ainsi, le seul mécanisme physiologique identifié pour expliquer la variation des taux de FVIII en fonction du groupe ABO est une action indirecte de celui-ci via les taux de vWF (rev. dans [92]).

Gènes structuraux du vWF et du FVIII

Le gène structurel de vWF, situé en 12p13, mesure 180 kb et contient 52 exons. Quatre SNPs de la région régulatrice 5’ [-3268 C>G (rs7965425), -2709 T>C (rs7964777), -2661 G>A (rs7954855), -2527 A>G (rs7965413)] en fort déséquilibre de liaison se trouvaient significativement associés aux taux de vWF dans un échantillon de 261 personnes en bonne santé du groupe O [93][94]. A partir de la séquence d’ADN de la région, les auteurs de ce travail ont déduit les facteurs transcriptionnels susceptibles de réguler la transcription de VWF. Ils ont montré que l’un de ces facteurs, NFκB, présentait une meilleure affinité avec -3268C et – 2709T qu’avec -3268G et -2709C. De plus, un autre polymorphisme de la région régulatrice en 5’ (une répétition en tandem GT) semblait intervenir dans l’augmentation de transcription de vWF dans des conditions de stress des cellules endothéliales (« shear stress ») [95]. Cependant, les associations entre ces divers polymorphismes et les taux de vWF n’ont pas été reproduites dans une étude épidémiologique incluant 400 personnes en bonne santé, même après stratification sur le groupe ABO [96].
Un autre polymorphisme, rs1800386 A>G, rare (<0.5%), situé dans l’exon 28 de VWF, responsable d’un changement d’acide aminé Tyr / Cys en position 1584 a été trouvé enrichi dans un échantillon de patients atteints de maladie de von Willebrand (maladie hémorragique liée à un défaut quantitatif ou qualitatif du vWF) [97]. L’acide aminé Cys confère à la protéine vWF une plus grande susceptibilité à l’activité protéolytique d’ADAMTS13. Enfin, les taux de vWF étaient plus bas parmi les porteurs de l’allèle rs1800386-G dans un échantillon de 5 000 donneurs de sang en bonne santé, probablement en raison d’une augmentation de la clearance de vWF [98][99].
Enfin, une étude récente a sélectionné 27 SNPs au sein de VWF, capturant entre 70 et 95% de la variabilité génétique de celui-ci, dont la totalité des polymorphismes communs (MAF>5%). Trois d’entre eux (rs7306706, rs216318 et rs4764478) étaient associés aux taux de vWF, mesurés dans une étude cas-témoins qui incluaient 421 jeunes patients ayant présenté une thrombose artérielle [100]. De plus, deux autres SNPs (rs1063857, rs216293) étaient associés au risque de survenue de thrombose artérielle. Il est intéressant de noter que rs1063857 était également associé au taux de vWF dans une étude pangénomique (décrite au §IV.3.2.2 p28) [101].
Le gène F8 contient 26 exons et s’étend sur 186 kb. Tandis qu’environ mille mutations non-sens sont responsables de déficit en FVIII à l’origine de thrombophilie, un seul polymorphisme (et les polymorphismes en déséquilibre de liaison avec lui) a été décrit à ce jour comme étant peut-être associé au taux de FVIII. En effet, Viel et al [102] ont séquencé toutes les régions fonctionnelles du gène F8 chez 147 personnes issues de 7 populations différentes (espagnols caucasiens, afro-américains, chinois, japonais, mexicains indiens, americains andins, asie du sud-est) et identifié 48 polymorphismes. Ils ont ensuite testé, dans l’échantillon familial de la GAIT Study (voir §III.4.3 p22), les associations entre les 12 polymorphismes présents chez les caucasiens et l’activité du FVIII. Une seule était significative (p<0,007). Elle était observée pour un SNP non synonyme, rs1800291C>G, dont l’allèle C était associé à une élévation des taux de FVIII (p=0,02).
La même association était observée chez près de 300 femmes dont la moitié présentait une MTEV [103], et dans une étude combinant trois échantillons cas-témoins, totalisant 2 500 individus dont le tiers présentait une MTEV [104]. Par ailleurs, ces deux études cas-témoins, ainsi qu’une étude prospective de 5 000 personnes, dont 184 ont développé une MTEV durant un suivi médian de 9 ans [67], observaient une tendance à une association entre rs1800291-C et une augmentation du risque de survenue de la MTEV, bien qu’aucune n’atteignît la significativité.

Low-density Lipoprotein Receptor-related Protein (gène LRP-1), en 12q13 et LDLR en 19p13

La protéine LRP (gène LRP-1) est un récepteur d’endocytose ubiquitaire multifonctionnel, internalisant divers ligands extracellulaires. Des expériences in vitro ont montré que le FVIII était capable de se fixer à la LRP [105][106]. Par ailleurs, il a été montré chez la souris que la désactivation de la LRP entraînait une élévation du FVIII et de vWF [107]. Plusieurs équipes ont étudié les associations entre les taux de FVIII et quelques polymorphismes rares (MAF<5%) du gène LRP-1, parmi lesquelles trois étaient significatives : D2080N (rs34577247 G>A), -25C>G (rs35282763) et 663 C>T (rs138358068), [84][108][109]. En particulier, le polymorphisme 663 C>T était de plus associé au risque de MTEV dans une étude incluant 150 cas et 200 (OR=3,3 IC95 [1,3-8,5]) [109]. Par ailleurs, les domaines de fixation à la LRP du FVIII ont fait l’objet d’une recherche de polymorphismes par Morange et al. Aucun polymorphisme n’a été retrouvé dans un échantillon de 20 individus non apparentés et présentant des valeurs très contrastées de FVIII [84]. LRP-1 appartient à la famille des gènes LDLR. Il coopère avec LDLR, un autre gène de cette famille, qui participe également au catabolisme du FVIII. Plus récemment, une étude cas-témoins de la maladie coronaire a mis en évidence l’association entre deux SNPs (rs688 et rs222867) et le taux d’activité plasmatique de FVIII, ainsi que l’association entre rs688 et la maladie coronaire [110].

Table des matières

I. La Maladie Thromboembolique Veineuse : définitions, épidémiologie, physiopathologie
I.1. Définitions
I.2. Epidémiologie générale
I.3. Physiologie de l’hémostase
I.3.1. L’hémostase primaire
I.3.2. L’hémostase secondaire
I.3.2.1. Démarrage de la production de thrombine
I.3.2.2. Amplification de la production de thrombine
I.3.2.3. Arrêt de la production de thrombine
I.3.3. Fibrinolyse
I.4. Physiopathologie de la MTEV
II. Etiologie de la MTEV
II.1. Facteurs démographiques : sexe, âge, ethnie
II.2. Facteurs de risque acquis
II.3. Facteurs de risque génétiques bien établis
II.3.1 Les déficits en inhibiteurs de la coagulation : antithrombines, protéines C, protéine S
II.3.2. Les mutations de facteurs de la coagulation : mutation du Facteur V de Leiden (FVL), et mutation du Facteur II G20210A (mutation du gène de la prothrombine)
II.3.3. Le groupe sanguin ABO
III. Recherche contemporaine de nouveaux facteurs de risque génétique de la MTEV
III.1. Généralités
III.2. Approche gène candidat
III.3. Approche pangénomique
III.3.1. Analyse de liaison suive d’association au sein de régions candidates
III.3.2. Les études d’association génome-entier (GWAS en anglais)
III.4. Etude de phénotypes intermédiaires de la MTEV
III.4.1. Généralités
III.4.2. Taux plasmatiques de facteurs biologiques associés à la MTEV
III.4.3. Héritabilité des phénotypes intermédiaires de la MTEV
IV. Objectif de la thèse
IV.1. Enoncé de l’objectif
IV.2. Justification de l’objectif
IV.3. Etat des connaissances sur le sujet de cette thèse
IV.3.1. Approche gènes candidats
IV.3.1.1 Association entre le gène ABO (chromosome 9q34) et les taux de FVIII et Vwf
IV.3.1.2. Gènes structuraux du vWF et du FVIII
IV.3.1.3. Low-density Lipoprotein Receptor-related
IV.3.2. Approche pangénomique
IV.3.2.1 Analyse de liaison suivie d’association au sein de régions candidates
IV.3.2.2. Analyse d’association pangénomique (GWAS)
V. Données disponibles pour la réalisation de ce travail
V.1. Les sujets étudiés
V.1.1. Echantillons dans lesquels les taux de vWF et l’activité plasmatique de FVIII ont été mesurés
V.1.2. Echantillons cas-témoins sur la MTEV
V.2. Les données génétiques
V.2.1. L’échantillon FVL
V.2.2. MARHTA08 et MARTHA10
V.2.3. L’étude GWAS sur la MTEV (données in silico).
V.2.4. Stanislas, MARTHA05 et FARIVE
V.3. Mesure des traits quantitatifs
VI. Méthodes d’analyse statistique
VI.1. Analyse de liaison dans l’échantillon Familles-FVL
VI.1.1. Présentation des méthodes classiques d’analyse de liaison
VI.1.2. Principe des statistiques bayésiennes par une méthode de Monte Carlo par Chaînes de Markov (MCMC)
VI.1.3. Application aux analyses conjointes de ségrégation et de liaison
VI.1.4. Exploitation des résultats obtenus à la suite d’une analyse conjointe de liaison et de ségrégation : graphiques, Facteur Bayésien, et valeur de p empirique
VI.1.5. Conclusion sur les analyses conjointes de liaison et de ségrégation par MCMC
VI.2. Analyse d’association pangénomique (GWAS) en présence de données familiales par une méthode de décomposition de la variance
VI.2.1. Notions de décomposition de la variance phénotypique et d’héritabilité
VI.2.2. Modélisation de la variable phénotypique
VI.2.3. Prise en compte des corrélations intra-familiales par une matrice de variance-covariance
VI.2.4. Estimation de l’effet d’un SNP sur le phénotype par maximisation de la vraisemblance
VI.3. Analyses d’association en présence de données familiales par la méthode des Equations d’Estimation (EE)
VI.3.1. Principe général des EE
VI.3.2. Test de l’effet d’un SNP sur le phénotype
VI.4. Méthodes d’analyse d’association utilisées dans les échantillons d’individus non apparentés
VI.4.1. Trait quantitatif
VI.4.2. Trait qualitatif (GWAS in silico, MARTHA05 et FARIVE)
VI.5. Méta-analyse des GWAS réalisées dans les Familles-FVL,
VI.5.1. Présentation générale
VI.5.2. Effet fixes, effets aléatoires, mesure Q de l’hétérogénéité
VI.5.3. Autres mesures de l’hétérogénéité
VII. Identification des gènes BAI3 et STAB2 comme nouveaux déterminants génétiques des taux de FVIII et vWF à partir d’une analyse de liaison génétique
VII.1. Analyses de liaison pangénomiques des taux de vWF et FVIII dans l’échantillon Familles –FVL
VII.1.1. Analyse du taux de plasmatique de vWF
VII.1.2. Analyse des taux de FVIII non ajustés, puis ajustés, sur les taux de vWF
VII.1.3. Stratégie pour l’étude plus fine des signaux de liaison observés
VII.2. Etude d’association de polymorphismes du gène BAI3 dans l’échantillon familial de la cohorte STANISLAS
VII.3. Réplication de l’association entre les SNPs rs9363864 et rs3798992 du gène BAI3 et le taux de vWF (cas de l’échantillon MARTHA05)
VII.4. Association entre les polymorphismes rs9363864 et rs3798992 du gène BAI3 et le risque de MTEV (échantillons MARTHA05 et FARIVE)
VII.5. Discussion
VIII. Identification de nouveaux déterminants génétiques des taux de vWF et FVIII par des analyses d’association pangénomique
VIII.1. Analyse d’association pangénomique de l’échantillon Familles-FVL
VIII.1.1. Analyse des taux plasmatiques de vWF
VIII.1.2. Analyse pangénomique de l’association génétique du taux de vWF ajusté sur le gène ABO dans les familles-FVL
VIII.1.3. Analyse des taux plasmatiques de FVIII
VIII.1.4. Réplication dans les études MARTHA08 et MARTHA10
VIII.1.5. Discussion
VIII.2. Méta-analyse de trois études d’association pangénomique sur les taux plasmatiques de vWF et FVIII
VIII.2.1. Présentation globale des résultats
VIII.2.2. Examen des signaux d’association (p<10-5) détectés pour les taux de vWF
VIII.2.3. Examen des signaux d’association (p < 10-5) détectés pour les taux de FVIII
VIII.2.4. Validation de travaux antérieurs
VIII.2.5. Influence sur le risque de MTEV des polymorphismes mis en évidence par cette méta-analyse
VIII.2.6. Discussion
DISCUSSION GENERALE : BILAN, PERSPECTIVES, CONCLUSION
BIBLIOBRAPHIE

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