Ravensara Aromatica Sonnerat

Le taux d’endémicité de la flore et de la faune malgache s’élève à environ 80% (Andrianoelina et al., 2006, Rasoanaivo, 1990). Les espèces forestières doivent leur importance à leur utilisation, pouvant être à l’origine d’une menace de surexploitation des ressources. En effet ces essences sont en grande partie des plantes médicinales, comprenant entre autres des espèces aromatiques qui sont utilisées tant en médecine moderne que traditionnelle. L’engouement des pays développés au retour à la santé verte a incité les exploitants à s’intéresser de nouveau à ces plantes, notamment Ravensara aromatica (Tuley de Silva, 1996). Ravensara aromatica Sonnerat, famille des Lauraceae, espèce endémique de la forêt tropicale humide sempervirente, de moyenne altitude, dans le centre Est de Madagascar (Humbert, 1950) possède des vertus stimulantes, antivirales et décongestionnantes probablement dues aux différents composés chimiques présents dans son huile essentielle. Cette dernière est mise en vente sur le marché internationale, via les sites web spécialisés depuis une dizaine d’année. Cependant ces produits ne sont pas encore standardisés et la composition chimique de chaque flacon est variable même pour un distributeur (Andrianoelisoa, non publié). A l’issue de cette constatation, des analyses d’huiles essentielles de R. aromatica ont été effectuées par Andrianoelisoa et al., 2006 issues d’individus de différentes populations de la région de Moramanga afin de déceler les différentes compositions chimiques ou types chimiques caractérisant le R. aromatica. Les analyses ont été menées par Chromatographie en Phase Gazeuse ou CPG et quatre (4) types chimiques ont été définis suivant le ou les composants majoritaires rencontrés dans l’extrait d’huile dont:
– Type chimique 1 à dominance methyl chavicol
– Type chimique 2 dominé par methyl eugenol
– Type chimique 3 dont les composés majoritaires sont α-terpinène, limonène
– Type chimique 4 caractérisé par sabinène, linalol, terpinène .

Ravensara aromatica Sonnerat

Systématique

Règne : Végétale
Sous-règne : Métaphytes
Embranchement : Spermaphytes
Sous-embranchement : Angiospermes
Division : Magnoliophyta
Classe : Magnoliopsida
Sous-classe : Magnoliidae
Ordre : Laurales
Famille : Lauraceae
Genre : Ravensara
espèce : aromatica
Auteur : Sonnerat

Noms vernaculaires : Avozo (Bezanozano, Betsimisaraka), Havozo (Sihanaka, Bezanozano, Tanala), Hazomangidy (Bezanozano, Betsimisaraka), Hazomanitra (Bezanozano), Hazomanga (Betsimisaraka, Bezanozano, Tanala, Taimoro), Laposinty ou Ilaposity (Merina, Bazanozano), Ravintsara (Betsimisaraka, Tsimihety, Taisaka), Tavolomanitra (Tanala), Voaravintsara (Betsimisaraka), noix de girofle, 4 épices .

L’espèce Ravensara aromatica présente plusieurs synonymes (Kostermans A.G.H.,1958):
Agathophyllum aromaticum Willd,
Agathophyllum ravensara Mirbel,
Evodia aromatica Poiret,
Evodia ravensara Gaetner,
Laurus aromatica Baillon,
Ravensara anisata Danguy .

Description morphologique (Humbert, 1950) 

Ravensara aromatica est un arbre dont l’écorce, les feuilles et les fruits sont très odorants. La plante est très appréciée pour la production d’essence et surtout comme condiments. L’espèce fait partie de l’appellation commerciale « quatre épices » car leur parfum rappelle à la fois le laurier, le girofle, la cannelle et l’anis. Dans les anciennes littératures, la confusion était observée entre le Cinnamomum camphora ou Ravintsara et le Ravensara aromatica ou Hazomanitra qui appartiennent à deux genres différents, de la même famille.

Appareil végétatif

Ravensara aromatica est un arbre de 18 à 20 m de haut. Son tronc est muni de contre fort à l’âge adulte. Ses rameaux sont glabres, cylindriques et possèdent des bourgeons pubescents. Son écorce épaisse est parsemée de lenticelles rougeâtres. Elle est très aromatique, à goût amer et brûlant. Son bois est de couleur blanc jaunâtre, il n’est pas exploité en tant que bois d’oeuvre. Les feuilles sont simples, alternes, elliptiques, et coriaces. Elles ont une face supérieure verte, lisse, et brillante, et une face inférieure terne. Le pétiole est épais, lisse, sans stipule.

Appareil reproducteur

Les fleurs sont petites, vertes, et garnies de poils dressés en insertion elliptique. Les fruits sont des drupes (Figure 1), globuleuses, atteignant un diamètre de 2,5cm ou plus, avec une dispersion barochore. L’enveloppe aromatique du fruit est mince, charnue, lisse, avec un calice persistant. L’odeur est caractéristique, leur goût est amer et très brûlant, dû à la présence d’eugénol (Dragen-Dorff, cité par Humbert, 1950). La période de floraison se situe entre les mois de décembre et janvier, et la maturité des fruits entre juin et août.

Utilisations de la plante

L’huile essentielle de Ravensara aromatica est d’une grande efficacité contre les maladies virales, infectieuses et bactériennes. Grâce à ses propriétés immunostimulantes, elle protège l’organisme contre la varicelle, l’hépatite virale, la coqueluche, et les infections concernant les voies respiratoires comme la sinusite, le rhume, la bronchite. Elle a un fort pouvoir expectorant, c’est-à-dire libérant les voies respiratoires grâce à son action fluidifiante sur les sécrétions bronchiques. Elle est également efficace pour le traitement de la peau tels que l’herpès (labial ou génital), et surtout le zona (KALYX, 2004) Cette huile est également stimulante et aide à combler les baisses de forme (physique et mentale). De même le stress et l’insomnie seraient vaincus par ses vertus apaisantes. Elle peut aussi agir sur les douleurs articulaires et musculaires (NATURESGIFT, 2004). D’après Lecompte (cité par Humbert, 1950), le bois n’est ni utilisé en menuiserie ni dans la charpente, bien qu’étant léger à l’état sec, le bois ne supporte pas l’humidité.

Utilisation de la biologie moléculaire 

La découverte de la PCR (Polymérase Chain Reaction) a permis de développer de nouvelles méthodes de marquage moléculaire, comme la technique RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Cette dernière méthode consiste à digérer l’ADN génomique total extrait d’un matériel végétal, avec une enzyme de restriction. Le produit de digestion permet d’obtenir des fragments polymorphes de tailles différentes (Santoni et al., 2000). Mais s’il est facile d’obtenir de nombreuses coupures, la visualisation du gel après migration du produit de digestion est plus délicate. En effet, l’électrophorèse sur gel du produit de digestion, suivi d’une révélation avec un réactif coloré, génère une traînée (smear). Dans ce cas, la combinaison de la PCR et de la technique RFLP s’avère plus intéressante et plus efficace. Le nombre de coupure est moins important, donc plus facile à identifier et à interpréter.

Technique PCR 

Historique
La PCR est une méthode mise au point en 1985 par Kary Mullis qui a obtenu le prix Nobel de Chimie en 1993 (NANOWORD, 2006). Cette technique permet d’obtenir une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN par clonage artificiel dans un intervalle de temps court. Cette découverte a permis de résoudre des problèmes d’ordre criminel, ou encore les questions sur l’évolution de l’être vivant. Effectivement, un échantillon, aussi infime soit-il, contenant le code génétique d’un individu, suffit pour obtenir des milliers de copies, pour effectuer ainsi des analyses.

Principe
La réaction PCR permet d’amplifier in vitro une région spécifique d’un acide nucléique donné afin d’en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier (Etienne, 1993). La réaction nécessite un mélange réactionnel appelé communément MIX. Ce mélange est constitué de plusieurs réactifs, ayant chacun un rôle précis durant l’amplification. La réaction PCR est catalysée par une enzyme thermostable, la Taq polymérase, en présence d’ADN, de paires d’amorces, des desoxyribonucléotides ou dNTP et de dichlorure de magnésium ou MgCl2 (GNIS, 2006). Les composants du MIX sont tous en solution, facilitant ainsi le mélange.

Composants du mélange réactionnel (MIX) 

ADN matricielle
L’ADN matricielle ou l’ADN cible est une séquence de nucléotides à double brin issue de l’extraction. Elle est généralement diluée suivant la qualité et la quantité d’extrait obtenue. Une quantité d’ADN trop importante au départ est limitante pour une activité optimale de l’ADN polymérase.

Paires d’amorces
Les amorces sont des séquences d’ADN simple brin, composées de 20 à 30 nucléotides, préparées in vitro. Ce nombre tient une grande place dans la spécificité de l’amorce à s’hybrider sur l’ADN matrice. Plus ce nombre de bases est élevé, plus la chance pour l’amorce de trouver sa séquence complémentaire dans l’ADN matricielle est faible et les risques d’hybridation non spécifiques sont grands. Dans le monde végétal, trois types d’amorces peuvent être utilisés, ils dépendent du type d’ADN à amplifier:
– les amorces nucléaires, spécifiques au génome nucléaire,
– les amorces chloroplastiques, spécifiques au génome chloroplastique,
– les amorces mitochondriales, spécifiques au génome mitochondrial.
Parmi ces trois types d’amorces, chacun peut encore être soit spécifique à une espèce ou à une famille, soit universelle, c’est-à-dire pouvant amplifier différentes familles de plantes. Le choix des amorces est primordial dans une PCR. Les amorces possèdent un double rôle, en premier de délimiter la zone d’amplification, elles se fixent de part et d’autres de la zone à amplifier. En second, leurs extrémités 3′ servent de site d’amarrage pour l’ADN polymérase. Les amorces vont toujours de paires dans une réaction PCR, l’une va s’hybrider sur le brin 5’3′ de l’ADN matrice, et l’autre sur le brin 3’5′. Les amorces s’hybrident aux extrémités de la séquence qui va être amplifiée, il faut donc connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région de l’ADN à amplifier. Les amorces choisies lors d’une nouvelle réaction PCR sur une plante donnée, ont été sélectionnées à partir d’anciennes références, ou en allant sur des sites spécialisées sur Internet tel que le site web suivant www.ncbi.nlm.nih.gov .

Table des matières

INTRODUCTION
GENERALITES
A. RAVENSARA AROMATICA SONNERAT
A.I. SYSTEMATIQUE
A.II. DESCRIPTION MORPHOLOGIQUE (HUMBERT, 1950)
A.II.1. Appareil végétatif
A.II.2. Appareil reproducteur
A.II.3. Utilisations de la plante
B. UTILISATION DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE
B.I. TECHNIQUE PCR
B.I.1. Historique
B.I.2. Principe
B.I.3. Composants du mélange réactionnel (MIX)
B.I.3.1. ADN matricielle
B.I.3.2. Paires d’amorces
B.I.3.3. Taq polymérase
B.I.4. Phases de la PCR
B.II. TECHNIQUE CAPS OU PCR/RFLP
B.II.1. Principe de l’électrophorèse
B.II.2. Révélation
B.II.3. Notion de Polymorphisme
MATERIELS ET METHODES
A. MATERIEL VEGETAL
B. SITES D’ETUDES
B.I.1. Ecosystème
B.I.2. Choix des sites d’études
Didy
Raboana
Anosibe an’Ala
C. TRAVAUX SUR TERRAIN
Mesure de l’altitude
C.I. REPERAGE DES INDIVIDUS
C.II. QUADRILLAGE DU SITE
C.III. POSITIONNEMENT DES INDIVIDUS ET MARQUAGE
C.IV. COLLECTE ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS
C.V. MISE EN HERBIER
D. TRAVAUX DE LABORATOIRE
D.I. ETUDE CHIMIQUE
D.I.1. Distillation
D.I.2. Analyse chimique
D.II. ETUDE DE LA VARIABILITE GENETIQUE
D.II.1. Protocole d’extraction
D.II.1.1. Extraction
D.II.1.2. Vérification de l’extrait
D.II.1.2.a. Quantification de l’ADN par électrophorèse
D.II.1.2.b. Migration sur gel d’agarose 0.8%
D.II.1.2.c. Révélation sous ultra violet
D.II.2. Amplification in vitro par la technique PCR
D.II.2.1. Protocole d’amplification
D.II.2.2. Vérification de l’amplicon ou produit d’amplification
Migration sur gel d’agarose 1.5% et révélation
D.II.3. Digestion enzymatique
D.II.3.1. Protocole de digestion
Température d’inactivation
D.II.3.2. Vérification du produit de la digestion
Migration sur gel d’acrylamide 8% et révélation
Révélation
D.III. ANALYSE STATISTIQUE (DARWIN)
RESULTATS ET INTERPRETATIONS
A. REPARTITION SPATIALE DES TYPES CHIMIQUES
A.I. TYPES CHIMIQUES
A.II. DISTRIBUTION SPATIALE
A.II.1. Site de Raboana
A.II.2. Site de Didy
A.II.3. Site de Anosibe an’Ala
B. ANALYSE GENETIQUE
B.I. EXTRAIT D’ADN
B.II. PRODUIT DE L’AMPLIFICATION IN VITRO
B.III. VARIABILITE GENETIQUE
C. ANALYSE STATISTIQUE
DISCUSSIONS
CONCLUSION

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