RAPPELS SUR LES RADICAUX LIBRES ET LES ANTIOXYDANTS

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Action sur les protéines

Les protéines cellulaires sont une cible idéale de l’attaque radicalaire qui se situe à différents niveaux. Les groupements sulfhydriles, présent dans de nombreuses membranes d’enzymes, subissent sous l’action des RL, une déshydrogénation avec création de ponts disulfures et inactivation de ces enzymes (Logani et Davies, 1980).
Des cas d’activation enzymatiques peuvent être rencontrés lors de l’inactivation d’un inhibiteur spécifique :
• Les protéines de structure sont dépolymérisées (acide hyaluronique) sous l’action des RL ou polymérisées de façon anarchique. Ainsi, le collagène est dégradé avec malformation des fibres et fragilisation des vaisseaux sanguins ( Halliwell et Gutteridge, 1989).
• Les acides aminés peuvent être modifiés. Par exemples, l’action de l’oxygène singulet sur la méthionine donne la méthionine sulfoxyde (Halliwell et Gutteridge, 1989).
• Le radical hydroxyle réagit avec la phénylalanine et donne l’ortho-tyrosine ou le para- tyrosine.

Action sur les acides nucléiques

Les acides nucléiques sont particulièrement sensibles à l’action des RL qui créent des sites radicalaires au sein de la molécule et peuvent ainsi induire des effets mutagènes ou l’arrêt des réplications.
Outre cette action directe sur l’ADN, les radicaux libres altèrent la synthèse et la réplication de l’ARN. Cette attaque provoque une baisse de concentration intracellulaire de la coenzyme NAD+, secondaire à son clivage par l’enzyme poly (ADP-ribose) synthétase, avec transfert de l’ADP-ribose sur la protéine nucléaire (Hoff et O’Neill, 1991).

Action sur les lipides

Les RL peuvent attaquer les lipides et notamment les acides gras mono et polyinsaturés (AGPI) des phospholipides membranaires et sont à l’origine des réactions de peroxydation (Morelle et al, 1998).
Il s’agit d’une succession de réactions radicalaires à l’origine de la libération de molécules réactives. En l’absence d’antioxydants, la réaction s’auto-entretient car les espèces produites peuvent à nouveau réagir entre elles. Cette réaction est à l’origine de la formation d’hydroperoxydes lipidiques. Ceux-ci s’accumulant dans la membrane, entrainent ainsi la diminution de sa fluidité et de sa perméabilité. Sa fonction étant complètement perturbée, la membrane se désorganise. Si les dégâts sont trop importants, les peroxydes lipidiques peuvent aussi réagir avec d’autres composés cellulaires et être à l’origine de molécules très toxiques. Par exemple, ils peuvent réagir avec l’ADN et être à l’origine de substances mutagènes.

Systèmes antioxydants

Ces systèmes peuvent être d’origine endogène ou exogène.

Systèmes antioxydants endogènes

Systèmes enzymatiques

Superoxydes dismutase

Les superoxydes dismutases (SOD) sont des métalloprotéines responsables de la dismutation spontanée du radical superoxyde en peroxyde d’hydrogène selon la réaction ci- dessous. 2O2●˗ + 2H+ H2O2 + O2
Elles sont de trois types :
– une SOD à cuivre et à zinc (Cu/Zn-SOD), intercellulaire, située dans le cytoplasme et dans l’espace inter-membranaire des mitochondries ; elle exerce une action antioxydante importante dans l’espace intermédiaire mitochondriale où il y a une accumulation importante de protons.
– une autre SOD à cuivre et à zinc est extracellulaire, localisée principalement dans la matrice extracellulaire des tissus et à un degré moindre dans les liquides extracellulaires des tissus (plasma, lymphe) ; elle joue un rôle important dans la protection des surfaces cellulaires et des protéines de la matrice extracellulaire contre l’action des O2●˗.
– une SOD à manganèse (Mn-SOD) qui est située à la fois dans la matrice et au niveau de la membrane interne de la mitochondrie.
Le peroxyde d’hydrogène formé peut être à son tour éliminé par deux autres enzymes : la catalase et la glutathion peroxydase (Beguel, 2012).

La catalase

La catalase est une enzyme composée de quatre chaines polypeptidiques. Son site catalytique permet l’élimination du peroxyde d’hydrogène, présent à haute concentration.

Glutathion peroxydase

La glutathion peroxydase (GPX) est une enzyme dépendante du sélénium qui a une forte affinité pour le peroxyde d’hydrogène; elle permet donc l’élimination du peroxyde d’hydrogène, même présent à faible concentration.
Le maintien de l’activité de la GPX nécessite la régénération du glutathion (GSH) assurée par la glutathion réductase.

Systèmes non enzymatiques

Le glutathion

Le glutathion est un tripeptide (acide glutamique-cystéine-glycine). Il est le thiol (-SH) majoritaire au niveau intracellulaire (l’albumine étant son équivalent plasmatique) ou il est présent sous forme essentiellement réduite (GSH).
Dans des conditions physiologiques, sa forme oxydée(GSSG) est en concentration très faible. Le rapport GSH/GSSG est considéré comme un excellent marqueur de la peroxydation lipidique et permet d’objectiver l’importance du stress.
Lors du vieillissement ou d’un exercice intense, ce rapport tend à diminuer. Les autres propriétés antioxydantes du GSH sont nombreuses : cofacteur de la GPX, chélateur des métaux de transition, régénérateur final des vitamines E et C à partir de leur formes radicalaires (Wang, 1997).

La bilirubine

La bilirubine est un produit de la dégradation de l’hème et résulte essentiellement du catabolisme de l’hémoglobine par les cellules réticulo-endothéliales. Composé non hydrosoluble, elle se lie à l’albumine dans un rapport stœchiométrique 1/1, ce qui empêche sa pénétration dans les tissus riches en lipides tel que le cerveau. La bilirubine est capable de piéger le radical peroxyde et l’oxygène singulet. Ainsi, elle protège l’albumine et les acides gras liée à l’albumine des attaques radicalaires.

L’acide urique

L’acide urique est un produit terminal majeur du métabolisme des purines chez l’homme. Il est à pH physiologique majoritairement ionisé sous forme d’urate, un piégeur puissant des radicaux libres (OH●, ROO●, NOO● …). Ces réactions conduisent à des espèces radicalaires qui seront à leur tour réduites (notamment la vitamine C). Les antioxydants de l’urate in vivo peuvent être appréciées indirectement par le fait qu’un produit de réaction de l’urate avec les EOA, L’allantoïne, est présent à des taux élevés lors d’un stress oxydant (Delattre et al., 2005).

Le coenzyme Q10

Le coenzyme Q10 appelé ubiquinone en raison de son ubiquité dans les cellules, est un dérivé benzoquinolique avec une longue chaine latérale isoprénique. Cette chaine confère à la molécule un caractère lipophile qui lui permet de s’insérer dans les membranes et les lipoprotéines. Il joue un rôle essentiel dans la chaine mitochondriale de transport d’électron et est un puissant inhibiteur de peroxydation lipidique, en synergie avec la vitamine E.
Les œstrogènes, la mélanine, la mélatonine et l’acide lipoïque peuvent également être comptés au nombre des antioxydants non enzymatiques endogènes (Nakamura et al.,1980).

Antioxydants exogènes

Vitamine C

La plupart des mammifères sont capables de synthétiser la vitamine C au niveau du foie ou des reins. Ce n’est pas le cas de l’homme qui doit assurer un apport journalier d’environ 100mg via une alimentation. La vitamine C, illustrée par la figure 3, est un excellent piégeur des EOA (OH● ou O2●˗). Elle inhibe également la peroxydation lipidique en régénérant la vitamine E à partir de la forme radicalaire issue de sa réaction avec les radicaux lipidiques. Ses fonctions sont nombreuses : contribution au bon fonctionnement du système immunitaire, implication dans la synthèse du collagène et des globules rouges ainsi que dans les mécanismes de métabolisation du fer (Blot et al.,1993).

Extraction et fractionnement

Obtention de l’extrait

Cinquante-six grammes (56g) de poudre de feuilles de Combretum paniculatum sont portées à ébullition modérée sous reflux dans 1L d’éthanol à 90˚ pendant 30 minutes. Cette opération est effectuée à deux reprises. Après filtration à chaud, les extraits sont ensuite réunis. Le filtrat est évaporé à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif afin d’obtenir un extrait sec éthanolique. Une partie de cet extrait sec est ensuite soumise à un fractionnement liquide-liquide.

Fractionnement liquide-liquide

Le fractionnement de l’extrait éthanolique a été réalisé avec des solvants de polarité croissante (chloroforme, acétate d’éthyle et eau). Ainsi, l’extrait sec éthanolique est dissous dans 500ml d’eau distillée. La solution aqueuse est ensuite épuisée trois fois de suite par 400ml de dichlorométhane. Les phases dichloroméhaniques sont rassemblées puis évaporées à sec pour donner la fraction dichloroméhanique.
La phase aqueuse est soumise de nouveau à une extraction liquide-liquide avec de l’acétate d’éthyle dans les mêmes conditions que précédemment. Les phases d’acétate d’éthyle et aqueuses sont rassemblées séparément puis évaporées permettant d’obtenir les fractions correspondantes.

Activité antioxydante par la méthode FRAP

Protocole expérimental

Le pouvoir réducteur a été déterminé suivant la méthode décrite par Oyaizu (1986). Ainsi, 1 ml d’extrait ou de fractions à différentes concentrations dilué dans de l’eau distillée est mélangé avec 2,5 ml de la solution de tampon phosphate (0,2 M; pH 6,6) et 2,5 ml de ferricyanure de potassium (K3Fe(CN)6) à 1% dans un tube à essai. Ensuite 2,5 ml d’acide trichloracétique (10%) sont ajoutés à chaque tube après une incubation de 30 minutes à 50˚C. Le tout est ensuite centrifugé à 3000 tours par minute pendant 10 minutes. Puis 2,5 ml du surnageant sont mélangés avec 2,5 ml d’eau distillée et 0,5 ml de FeCl3 (0,1%). Les absorbances sont lues à 700 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.

Trois mésures sont effectuées pour chaque concentration de produit testé (n=3).

L’extrait éthanolique, ses fractions dichlorométhanique, d’acétate d’éthyle, aqueuse et l’acide ascorbique (choisi comme antioxydant de référence) sont testés aux concentrations suivantes : 15,62-31,25 -62,5 -125 et 250µg/ml.

Expression des résultats et analyses statistiques

L’activité antioxydante, qui exprime les capacités de l’extrait à réduire le fer, est estimée par les valeurs des absorbances obtenues en fonction des concentrations utilisées. Une croissance de l’absorbance suivant celle de la concentration correspond à une augmentation du pouvoir réducteur (PR) des produits testés. Le pouvoir réducteur, exprimé en pourcentage, est obtenu à partir de la formule suivante : PR = A1- A0 x 100 A0

Les analyses statistiques des résultats sont effectués à l’aide du logiciel « Statview » en procédant à une analyse normale des variantes (ANOVA) à l’aide du test de Fisher. La différence est considérée significative si p<0,05 versus témoin négatif.

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela chatpfe.com propose le téléchargement des modèles complet de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE I : PRESENTATION DE COMBRETUM PANICULATUM VENT(COMBRETACEAE)
I.1. SYNONYMES ET DENOMINATIONS
I.1.1. Synonymes
I.1.2. Dénominations particulières
I.2. BOTANIQUE
I.2.1.Position taxonomique
I.2.2. Description botanique
I.3 REPARTITION GEOGRAPHIQUE
I.4. CHIMIE
I.5. PHARMACOLOGIE
I.5.1. Usages ethnopharmacologiques
I.5.2. Propriétés pharmacologiques
CHAPITRE II : RAPPELS SUR LES RADICAUX LIBRES ET LES ANTIOXYDANTS
II.1.Définition
II.2. Espèces réactives de l’oxygène
II.2.1. Le radical superoxyde
II.2.2. Le radical hydroxyle
II.2.3. Le peroxyde d’hydrogène
II.3. Conséquences moléculaires du stress oxydant
II.3.1. Action sur les protéines
II.3.2. Action sur les acides nucléiques
II.3.3. Action sur les lipides
II.4. Systèmes antioxydants
II.4.1. Systèmes antioxydants endogènes
II.4.1.1. Systèmes enzymatiques
a. Superoxydes dismutase
b. La catalase
c. Glutathion peroxydase
II.4.1.2. Systèmes non enzymatiques
a. Le glutathion
b. La bilirubine
c. L’acide urique
d. Le coenzyme Q10
II.4.2. Antioxydants exogènes
II.4.2.1. Vitamine C
II.4.2.2. Vitamine E
II.4.2.3. Oligo-elements
a. Le sélénium
b. Le cuivre
c. Le zinc
II.4.2.4. Les caroténoides
II.4.2.5. Les polyphenols
CHAPITRE III : PRINCIPE DE LA METHODE FRAP
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
CHAPITRE I : MATERIEL ET METHODES
I.1 Matériel et réactifs
I.1.1. Matériel végétal
I.1.2. Le matériel de laboratoire
I.1.3. Les principaux réactifs utilisés
I.2. Méthodes
I.2.1.Extraction et fractionnement
I.2.1.1. Obtention de l’extrait
I.2.1.2. Fractionnement liquide-liquide
I.2.2. Activité antioxydante par la méthode FRAP
I.2.2.1 Protocole expérimental
I.2.2.2. Expression des résultats et analyses statistiques
CHAPITRE II: RESULTATS
II.1. Teneur en eau
II.1 Rendements d’extraction et de fractionnement
II.2 Activité antioxydante
II.2.1. Extrait éthanolique
CONCLUSION
REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES