Ralstonia solanacearum appliquée à l’épidémiologie du flétrissement bactérien de la pomme de terre

Les souches du ceRs sont présentes à Madagascar

               Signalées pour la première fois en 1934 par Bourriquet (1946) sur des cultures de tabac, le flétrissement bactérien est observé dans les zones maraîchères des Hauts Plateaux, des côtes Ouest et Est de Madagascar (Figure 3) à l’état endémique avec une incidence significative sur les cultures maraîchères telles que la tomate, l’aubergine, le tabac, l’arachide, le haricot ou la pomme de terre, (Rasolofo 1965). La pomme de terre est une culture vivrière et économiquement importante à Madagascar. Elle est cultivée sur plus de 50 000 Ha (CEFFEL 2014) en trois saisonssur ‘tanety’: culture pluviale (Novembre Mars) et culture intermédiaire (Janvier-Mai), sur ‘baiboho’, plaines et rizières : culture de décrue ou contresaison (Avril-Octobre). Le flétrissement bactérien se rencontre habituellement sur les cultures pluviales plantées sur les ‘tanety’ d’altitude (1200-1700m) en période chaude et humide (Lallmahomed & Rakotobe-Rabehevitra 1988 ; Rakotondramanana 1984) (données FIFAMANOR3 ). Elle se manifeste au stade d’initiation des tubercules et/ou stade de floraison de la pomme de terre. Durant des années, le flétrissement bactérien a été contrôlé par l’utilisation de semences saines, l’application de la rotation des cultures, et l’utilisation de variétés résistantes/tolérantes issues de la sélection de variétés améliorées – des accessions provenant du CIP4 et sélection réalisée depuis plusieurs années par FIFAMANOR. Une dizaine de variétés de pomme de terre estimées résistantes/tolérantes ont été, à cet effet, diffusées auprès des agriculteurs. Cependant depuis 2009, une épidémie de flétrissement bactérien sévit dramatiquement dans le bassin de production de pomme de terre de la Région Vakinankaratra. La fréquence est accrue chez les cultures de contre-saison cultivées sur rizières et sur sols volcaniques (données FIFAMANOR) où la maladie n’avait jamais été observée et avec d’inhabituelles périodes de développement des symptômes (GRET/CITE 2000 ; MAEP-UPDR 2004a ; Rabakoarihanta & Rakotondramanana 1984 ; Rakotondramanana 1984). Les symptômes apparaissent et se développent très tôt, au stade d’émergence complète et/ou au stade de développement végétatif. Les pertes aux champs sont importantes pouvant aller de 20 à 100 % et la maigre récolte est inapte à la conservation, à l’alimentation et à la commercialisation car les tubercules pourrissent rapidement (Andriamihaja 2013, enquêtes FIFAMANOR). Ces sept dernières années, le flétrissement bactérien ne cesse de gagner du terrain et progresse dans l’ensemble des bassins primaires de production de pomme de terre des Hauts Plateaux malgaches, et également dans quelques zones d’extension (Figure 4). Des données d’enquêtes récentes ordonnées par le Ministère de l’Agriculture malgache et la FAO ont révélé l’attaque du flétrissement bactérien dans la presque totalité des zones de production (FAO 2014 ; MinAgri 2015). La situation actuelle est alarmante avec un risque imminent de pandémie nationale. En pleine reconstruction après une sévère épidémie de mildiou non contrôlée vers 2003 – avec une chute flagrante d’environ 30 % de la production en tubercules et tubercules semences au niveau nationale (Figure 5) (FAOSTAT 2016), la filière pomme de terre à Madagascar demeure encore vulnérable. Cette recrudescence de flétrissement bactérien risque fort bien de la mettre en péril, repousse les efforts visant à assurer un bon niveau de sécurité alimentaire et donc la santé économique de Madagascar. Les agriculteurs sont aujourd’hui dans le désarroi total et abandonnent progressivement la culture. Dans ce contexte, la gestion du flétrissement bactérien est devenue une préoccupation d’ampleur nationale car les enjeux sont importants :  La pomme de terre contribue à la diversification alimentaire en zone urbaine, et complémente ou substitue le riz (base de l’alimentation) pendant la période de soudure (période où les récoltes précédentes sont épuisées et les nouvelles pas encore récoltées) en zone rurale (Andriamihaja 2013 ; GRET/CITE 2000 ; Rasolo et al. 1987).  C’est un des produits phares des Hauts Plateaux malgaches, notamment de la région Vakinankaratra qui produit environ 670 000 tonnes par an dont 40 % sont destinés pour la consommation et 60 % pour la vente (MinAgri 2015). Au niveau national, La pomme de terre est identifiée comme étant une filière d’exportation porteuse. En effet, Madagascar a exporté vers les îles voisines telles que les Comores, Maurice, Réunion, Mayotte, Seychelles (Lexp.mu 2004 ; Monty 2012 ; Rasolo et al. 1987).  La production nationale de tubercules semences de pomme de terre se retrouve aujourd’hui contrainte par le flétrissement bactérien. Les principales stations de production de tubercules semences sont malheureusement affectées par la maladie (données FIFAMANOR). L’indisponibilité en tubercules semences saines ne fait qu’aggraver la situation phytosanitaire à Madagascar car les producteurs ont recours à des tubercules semences non certifiées ‘indemnes’.  Les terrains infestés sont devenus impropres à la culture non seulement de la pomme de terre mais aussi d’autres Solanées comme la tomate. Ce qui réduit les surfaces exploitables.  Il n’existe pas de lutte curative, et une des seules alternatives, la lutte via l’utilisation de variété résistante peut être compromise par une grande variabilité génétique du pathogène. Les variétés de pomme de terre historiquement éprouvées comme résistantes/tolérantes au flétrissement bactérien succombent aujourd’hui à la maladie (données FIFAMANOR et enquêtes en 2013). La situation épidémiologique du flétrissement bactérien sur les cultures de pomme de terre sur les Hauts Plateaux malgaches a sans nul doute évoluée. Quels sont les déterminants de la dynamique des épidémies de flétrissement bactérien dans les bassins de production ? Voilà une question à laquelle nous allons tenter de répondre dans ce travail de thèse, in fine en vue d’orienter les décisions liées au développement de stratégies de contrôle efficaces contre cette maladie.

Critères de performance

1. La typabilité : c’est la capacité à attribuer un génotype à toutes les souches typées. C’est le pourcentage de souches assignées à un génotype sur le nombre total de souches testées.
2. Le pouvoir discriminant : c’est la capacité d’une méthode à attribuer un génotype différent à deux souches n’ayant aucun lien épidémiologique, choisies au hasard au sein d’une population d’une espèce donnée. C’est une qualité importante recherchée pour un système de génotypage. Il est exprimé par l’indice de discrimination de Simpson (Simpson 1949) modifiée par Hunter et Gaston (Hunter & Gaston 1988) : ???? = 1 −1?(?−1)∑ ??(?? − 1)?? = 1, où N représente le nombre total de souches du panel d’échantillons, S est le nombre total de génotypes décrits, nj indique le nombre de souches appartenant au j ème génotype. Une valeur de HGDI proche de 1 indique un fort pouvoir discriminant du système de génotypage.
3. La reproductibilité : c’est la capacité de la méthode à attribuer le même génotype à un isolat testé lors d’essais indépendants intra- et inter-laboratoires. Dans ce cas, il faut tenir compte de l’influence des différentes étapes impliquées dans le génotypage d’une souche par une méthode donnée comme dans la préparation du matériel génétique (par exemple, la variation du milieu de culture des souches ou de la méthode d’extraction de l’ADN) ; dans l’utilisation de différents ou même réactifs et équipements ; dans l’observation, l’enregistrement et l’interprétation des résultats. A ce propos, il faut disposer d’un protocole standardisé visant à fournir une méthode de génotypage fiable.
4. La stabilité : c’est la capacité à reconnaître la relation clonale des isolats dérivés d’une souche ancestrale commune, en dépit des variations qui peuvent survenir au cours de la conservation et de la réplication.
5. La concordance épidémiologique : c’est la capacité de faire des groupes de parenté et d’établir un niveau de parenté en accord avec le profil épidémiologique connu.
6. La concordance avec d’autres méthodes de génotypage. Il est intéressant d’évaluer pour les méthodes de génotypage utilisées, si les souches fortement similaires sont regroupées ou présentent une relation clonale avec d’autres méthodes.

REPRESENTATION DES RELATIONS GENETIQUES

                  La diversité génétique peut également être analysée et représentée sur un diagramme pour établir les relations génétiques (Robinson et al. 2010). Les données de séquences nucléotidiques, comme les marqueurs MLSA permettent la construction d’arbres phylogénétiques. Les différences ou les similarités observées sur un ou plusieurs gènes (marqueurs moléculaires) permettent de déduire les relations de parenté entre les souches. Il s’agit entre autres de réaliser un alignement multiple des séquences de gènes, grouper des souches apparentées i.e. qui présentent un ancêtre commun, et générer un arbre phylogénétique où les séquences les plus proches ne divergent qu’au fil des dernières branches de l’arbre, tandis qu’une ancestralité commune éloignée est marquée par un positionnement sur des branches très divergentes. En d’autres termes, chaque nœud de l’arbre représente l’ancêtre commun de ses descendants et les arêtes illustrent les liens de liaison. On distingue trois principales méthodes de reconstruction d’arbre phylogénétique (Didelot 2010).  Les méthodes fondées sur les distances entre séquences prises deux à deux qui regroupent ensemble les séquences les plus proches entre elles et de situer les différents niveaux de hiérarchie entre elles sur la base de l’intensité de leur ressemblance : la méthode UPGMA (Unweight Pair Group Method with Arithmetic mean) et la méthode NJ (Neighbour-Joining). Ces méthodes prennent en compte le nombre de substitutions de nucléotides pour estimer la distance entre deux séquences.  Les méthodes fondées sur les caractères qui prennent en compte le nombre de mutations (substitutions/insertions/délétions) qui affectent chacun des sites de la séquence : la méthode de Parcimonie (MP), la méthode de vraisemblance (ML). Ces méthodes sont plus précises.  La méthode bayésienne qui calcule la probabilité postérieure de toutes les topologies d’arbres phylogénétiques par la combinaison d’une probabilité à priori avec la fonction de vraisemblance. La méthode ML est la plus robuste. L’analyse phylogénétique complète les analyses obtenues sur la base des distributions alléliques. Cependant si les séquences de gènes utilisés comme marqueurs sont sujettes aux transferts horizontaux de gènes, il faut utiliser un réseau phylogénétique pour représenter leurs évolutions dans lequel les séquences sont représentées par des nœuds et leurs relations évolutives sont représentées par des arêtes (Kunin et al. 2005 ; Legendre 2000). L’homoplasie des séquences fait aussi parti des problèmes fondamentaux de l’inférence phylogénétique. Cet état brouille l’information phylogénétique pouvant entrainer de fausses interprétations des relations de parenté. L’homoplasie indique la ressemblance d’un état de caractère non hérité d’un ancêtre commun, les séquences de gènes peuvent afficher des similitudes mais ne possèdent pas les mêmes histoires de vie. On distingue trois types d’homoplasie (Figure 8) :  la convergence évolutive (présence de caractères similaires dans divers séquences sans lien de parenté, souvent lié à une adaptation au milieu),  l’évolution parallèle (deux séquences relativement proches évoluent de façon indépendante et présentent des caractères similaires, le caractère est issu d’un ancêtre commun),  la réversion évolutive (deux séquences présentent des états similaires par suite d’un retour à l’état ancestral d’au moins l’une d’entre elles. Ce retour à l’état initial se manifeste par une mutation (perte) au niveau de la séquence, la principale source d’homoplasie étant la recombinaison. Il a été démontré que la probabilité d’homoplasie d’un site augmente avec le nombre d’événements de recombinaison affectant le site. Ainsi, l’homoplasie est couramment utilisée comme indicateur de la prévalence de la recombinaison (Maynard Smith & Smith 1998 ; Smith 1999). Ainsi, dans la construction d’un arbre phylogénétique, il faut quantifier l’incertitude de la phylogénie inférée en estimant d’une part, l’influence de chaque nucléotide sur la phylogénie inférée et de retirer ceux qui ont une influence trop forte, par exemple à l’aide de la méthode Jackknife, pour éviter l’homoplasie qui n’a pas de valeur en phylogénie. D’autres part, si les jeux de données présentent une forte hétérogénéité, il est préférable d’explorer les différents modèles de substitution qui permettent de calculer les probabilités de remplacement d’un nucléotide par une autre décrivant la façon la plus réaliste possible le processus biologique d’évolution des séquences (Tagu & Risler 2010). En épidémiologie, une question importante est de savoir si deux ou plusieurs isolats dérivent de la même souche et de prouver la clonalité entre des isolats susceptibles d’être liées épidémiologiquement (Struelens 1998). La notion de clone définit un ensemble de souches bactériennes isolées indépendamment les unes des autres i.e. provenant de lieux différents et prélevés à différents moments, mais qui montrent des caractères génétiques très proches impliquant le fait qu’elles ont un ancêtre commun récent. Les souches impliquées dans une épidémie peuvent avoir une relation de clonalité qui n’exclue pas la présence de recombinaison voire de variation génétique. En effet durant la dissémination des clones, les marqueurs moléculaires peuvent être soumis à des forces d’évolution, d’où le concept de complexe clonal. Pratiquement, les isolats qui présentent le même profil allélique sont définis comme clones et les groupes d’isolats qui montrent des profils étroitement proches forment un complexe clonal. A partir des différents profils alléliques existants dans la population étudiée, générés par les données de génotypage MLST et MLVA, les liens génétiques entre les haplotypes peuvent être visualisés à partir d’un arbre couvrant minimum (‘minimum spanning tree’ des anglo-saxons) dont le concept d’origine applique le principe de parcimonie à la phylogénie. C’est un arbre réticulé dont la somme des longueurs de branches est minimale évoquant la quantité minimum d’évolution (Edwards & Cavalli-Sforza 1965). La taille de la population analysée ou l’ajout de nouveaux génotypes n’influent pas la structure de l’arbre car le principe de parcimonie sous-jacent permet de conserver les points de connexion des différents groupes. L’arbre couvrant minimum est construit avec l’algorithme goeBurst (Francisco et al. 2009) où chaque cercle représente un haplotype et les segments reliant deux haplotypes sont pondérés de distance euclidienne minimale entre les deux haplotypes. Les haplotypes sont regroupés en fonction du nombre de loci qui les différencient et leur fréquence. Les souches liées épidémiologiquement sont distantes entre elles d’un locus (SLV ou ‘single locus variant’) et forment un complexe clonal. L’analyse de l’arbre couvrant minimum fournit par ailleurs des informations sur la divergence allélique de l’haplotype central prédit comme fondateur ou ancêtre commun potentiel des haplotypes liés dans un complexe clonal. Sur la base de parcimonie, l’haplotype qui a le plus de grand nombre de SLV dans le complexe clonal est le fondateur primaire. Si deux haplotypes possèdent le même nombre de SLV alors celui qui a le plus grand nombre de DLV (‘double locus variant’) est choisi.

Source d’inoculum, mode de contamination et dispersion

                   Comme le spectre de plantes hôtes des souches du ceRs est très large, différentes espèces végétales ligneuses ou herbacées pourraient alors conserver cette bactérie à l’état symptomatique ou comme porteurs sains. Les débris de plantes, les plantes adventices qui servent d’hôte intermédiaire, et les matériels de multiplication végétative (tubercules semences, boutures) contaminés constituent d’importantes sources d’inoculum primaire. La bactérie peut se propager ensuite par le sol ou substrat, par les eaux d’irrigation et de ruissellement ou par les outils (Álvarez et al. 2010). L’homme est également un facteur de contamination lors des opérations culturales, et un facteur de dissémination par la multiplication, le transport de matériel végétal infecté d’un endroit à un autre. La bactérie peut également survivre sur le bois (plusieurs jours), le métal (plusieurs semaines), le caoutchouc (plusieurs mois), le fumier de bovins (2-4 semaines) et les déchets de l’industrie de la transformation de pommes de terre (1-2 mois) (Wenneker et al. 1998). Enfin, la transmission de proche en proche par les insectes comme les abeilles (Trigona corvine), les guêpes (Polybia spp), et les mouches (Drosophila spp) sont possibles par contamination de l’insecte ou transfert mécanique. Les insectes vecteurs propagent les infections de manière passive où les souches s’accrochent sur les parties du corps de l’insecte. Néanmoins, un mode de transmission biologique est possible. C’est le cas de la maladie de Sumatra du giroflier (R. syzygii) qui est transmis par Hindola sp, un homoptère cercopide. Lorsque l’insecte se nourrit dans les tissus conducteurs d’une plante infectée, il peut transmettre la bactérie par injection ou piqûre sur une autre plante. La transmission est de type persistant avec une période de latence d’environ 24 h mais peut être d’une durée plus courte (Agrios 2008 ; Eden-Green et al. 1992 ; Supriadi 2005).

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE
I. GENOTYPAGE BACTERIEN
Marqueurs moléculaires comme outil d’investigation
Technique de génotypage
Approches MLSA/MLST, MLVA
II. EXPLORATION DE LA DIVERSITE GENETIQUE
Variations génétiques
Diversité génétique intra-population
Structure des populations et flux de gènes
Représentation des relations génétiques
Diversité phénotypique
III. ABOUTISSEMENT ET PORTEE DES INVESTIGATIONS
MODELE D’ETUDE : LE FLETRISSEMENT BACTERIEN
IV. LE COMPLEXE D’ESPECES CHEZ RALSTONIA SOLANACEARUM
Description
Taxonomie et diversité génétique
Distribution et spectre d’hôte
Cycle infectieux, conservation et survie
Facteurs de virulence
Epidémiologie
Stratégies de lutte et de gestion
V. GENOTYPAGE APPLIQUE AUX SOUCHES DU ceRs
Diversité génétique, génétique des populations et phylogénie de la collection mondiale inférée par analyse MLSA
Marqueurs VNTRs à fort pouvoir de discrimination des souches du ceRs
OBJECTIFS ET QUESTIONS DE RECHERCHE
CHAPITRE 1. DÉVÉLOPPEMENT DU SCHÉMA MLVA DU PHYLOTYPE III
INTRODUCTION
METHODOLOGIE
RESULTATS ET DISCUSSION
CONCLUSION PARTIELLE
CHAPITRE 2. DIVERSITÉ GÉNÉTIQUE DU ceRs ET ÉPIDEMIOLOGIE
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
Constitution de la collection de souches du ceRs
Traitement des échantillons
Collection de souches
Caractérisation moléculaire des souches en collection
Enquête épidémiologique
Analyse des données
RESULTATS ET DISCUSSION
Ampleur de l’échantillonnage et collection de souches du ceRs
Phylotypes, spectre d’hôtes et distribution géographique
Identification de l’écotype ‘Brown rot’ IIB-1 et de sept sequevars
Populations endémiques diversifiées et complexes de souches malgaches de l’écotype africain phylotype III
Synthèse et analyses des données d’enquêtes
CONCLUSION PARTIELLE
CHAPITRE 3. ÉVALUATION PRÉLIMINAIRE DE LA RÉSISTANCE DES VARIÉTÉS CULTIVÉES À MADAGASCAR
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
Matériel végétal
Ralstonia solanacearum
Dispositif expérimental et inoculation
Suivi et mesure des symptômes
Analyses des données
RESULTATS ET DISCUSSION
CONCLUSION PARTIELLE
CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES
EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE : RS3-MLVA16 et RS2-MLVA9, deux puissants outils hautement résolutifs pour caractériser respectivement les souches du phylotype III et du phylotype II
DEUX MODELES EPIDEMIOLOGIQUES CONTRASTES AU SEIN DU ceRs : l’écotype ‘Brown rot’ et l’écotype ‘Africain’
EVALUATION DE LA RESISTANCE GENETIQUE des principales variétés de pomme de terre cultivées à Madagascar : pas de résistance aux souches malgaches ; résistance génétique des variétés 720118 (Jaingy) et 800934 (Miova) aux souches I-31
PRIORITES DANS LA STRATEGIE DE LUTTE contre le fletrissement bactérien dû aux souches de quarantaine IIB-1
APPROFONDIR LES CONNAISSANCES SUR LE PHYLOTYPE III et ériger en modèle d’étude la capacité à développer des infections latentes
ET DEMAIN
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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