Quelques notions de biologie moléculaire

Quelques notions de biologie moléculaire 

La biologie moléculaire est une science moderne en pleine explosion. En 1953, Watson et Crick proposent un modèle de la structure de l’ADN qui suggère comment l’information génétique est stockée au niveau moléculaire. En l’espace de cinquante ans des progrès impressionnants ont été réalisés, permettant de nos jours de réaliser le décodage de codes génétiques entiers, le clonage, des aliments transgéniques ou bien encore la thérapie génique.

Qu’est ce que l’ADN ?

Une succession de nucléotides 

L’ADN (acide désoxyribonucléique) est une succession de briques élémentaires composées d’un sucre à cinq carbones appelé désoxyribose, un groupement phosphate et une base azotée. Il existe quatre bases azotées pour l’ADN : l’adénine (A), la thymine (T), la cytosine (C) et la guanine (G). L’association d’un sucre, d’un phosphate et d’une base forme une sous unité appelée nucléotide (cf. figure 2.1). Ces nucléotides sont reliés de manière covalente pour former une chaîne polynucléotidique composée d’un squelette (alternance monotone de phosphates et de sucres) porteur d’une succession de bases azotées. Cette chaîne est appelée ADN simple brin. La succession de plusieurs bases représente une séquence génétique.

La double hélice

Lors d’un cycle cellulaire, l’ADN explore de multiples configurations topologiques. La structure la plus stable (dans une solution de salinité comparable à celle située au sein de la cellule et en l’absence d’enzymes) est constituée de deux chaînes polynucléotidiques complémentaires, maintenues ensemble par des liaisons hydrogène, et compactées sous la forme d’une double hélice . Deux couples de bases en vis à vis reliés par des liaisons hydrogène sont particulièrement stables :

il s’agit des paires de bases AT via deux liaisons hydrogène (A et T sont dites complémentaires) et des paires de bases GC via trois liaisons hydrogène (G et C sont dites complémentaires). En conséquence, deux simples brins portant des séquences de bases complémentaires s’associent dans une structure d’ADN double brin(cf. figure 2.2) : cette association est appelée hybridation. L’ensemble des liaisons hydrogène entre les bases complémentaires en regard, ainsi que les interactions attractives entre les bases empilées le long d’un simple brin d’ADN (forces de Van der Waals et interactions hydrophobes) stabilisent la structure double brin en s’opposant aux répulsions électrostatiques entre groupements phosphate chargés négativement. Cependant, l’énergie des liaisons hydrogène est relativement faible (de l’ordre de 10 à 40 kJ.mol−1 ), et il est possible de séparer les deux simples brins hybridés par une augmentation de température de quelques dizaines de Kelvin, selon la longueur de la chaîne : c’est la dénaturation. La forme la plus courante de l’ADN est la double hélice B. Dans ce cas, la distance entre deux bases successives est de 0, 34 nm et l’hélice fait un tour complet toutes les 10 bases. Ainsi, la longueur cristallographique d’une molécule double brin de 1000 paires de bases (1 kbp) est de 0, 34 µm. Le diamètre de la molécule double brin est de 2 nm. Il est aussi utile de savoir que 1, 52 picomol d’ADN de 1 kbp pèsent un microgramme. Il existe sous certains environnements ou contraintes d’autres formes stables de l’ADN. L’ADN-B est la forme présente dans les conditions physiologiques « standard », l’ADN-A (surenroulement) se retrouve dans des conditions de faible hydratation, l’ADN-S (complètement désenroulée, en forme « d’échelle ») lorsqu’on étire la molécule avec une force supérieure à 60 pN, l’ADN-Z ou ADN zigzag (double hélice gauche, elle n’a pas la même chiralité que les autres formes) lorsqu’on applique une torsion à la molécule ou encore l’ADN-P (dénaturation et orientation des bases vers l’extérieur de la double hélice).

De l’ADN aux protéines

Une molécule d’ADN double brin peut atteindre chez certains organismes jusqu’à un mètre de long (celle molécule est compactée dans la cellule). Il y a en général au sein d’une cellule plusieurs de ces molécules, le long desquelles on peut distinguer des sous-ensembles d’acides nucléiques, appelés gènes. L’ensemble des gènes d’un organisme vivant constitue son génome. Les quatres bases A T G et C de l’ADN constituent l’alphabet qui code l’information génétique. L’information contenue dans la séquence de bases associée à un gène permet de diriger la production de protéines et d’enzymes nécessaires au fonctionnement de la cellule. Cette information est la même pour toutes les cellules d’un même organisme (mis à part les gamètes). Cependant, tous les gènes ne sont pas exprimés de la même manière dans chaque cellule. Par exemple, certains des gènes exprimés dans une cellule de cheveux (production de kératine) doivent être différents de ceux exprimés dans une cellule pancréatique nécessitant une grande production d’insuline. Cela est assuré par un système complexe de régulation de l’expression des gènes. Sans entrer dans une description aussi détaillée, il est cependant possible de dégager les grandes lignes du processus permettant de passer de l’ADN en protéines. La synthèse protéique comporte deux étapes : la transcription et la traduction.

La transcription 

L’ADN n’est pas directement traduit en protéines. Il existe un intermédiaire, l’ARN (Acide Ribonucléique). La transcription de l’ADN en ARN a lieu en présence d’un substrat (l’ADN), d’une enzyme (l’ARN polymérase), d’ions Mg2+ et de ribonucléoside 5’-triphosphates qui servent de matière première. Les bases de ces nuclésosides triphosphates (ATP, GTP, UTP, CTP) sont quasi-identiques à celles utilisées pour la synthèse de l’ADN (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), à l’exception de la thymine (T) qui est remplacée par l’uracile (U) (les deux bases ne diffèrent que par un seul groupe methyl).

La transcripion de l’ADN en ARN se déroule en trois étapes :
– l’initiation consiste en la reconnaissance, par la polymérase, d’une séquence spécifique de l’ADN appelée promoteur, sur laquelle elle se fixe. Le promoteur marque en quelque sorte le début d’un gène. Pour un double brin d’ADN donné, un seul des brins est transcrit.
– l’élongation, dont on décrit schématiquement le principe sur la figure 2.4 est la phase durant laquelle la polymérase copie l’information génétique sous forme d’ARN. L’ARN est synthétisé de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’.
– la terminaison marque la fin de la transcription : une séquence spécifique arrête la polymérase qui se dissocie de l’ADN et de l’ARN.

Il existe très majoritairement trois types d’ARN : les ARN messagers (ARNm) codent pour des protéines, les ARN ribosomiques (ARNr) sont les constituants essentiels du ribosome, et les ARN de transferts (ARNt) sont des petits ARN dont le rôle lors de la traduction est détaillé par la suite .

Table des matières

1 Introduction
2 Quelques notions de biologie moléculaire
2.1 Qu’est ce que l’ADN ?
2.1.1 Une succession de nucléotides
2.1.2 La double hélice
2.2 De l’ADN aux protéines
2.2.1 La transcription
2.2.2 Structures secondaires et tertiaires de l’ARN
2.2.3 La traduction
2.3 Techniques de biologie moléculaire
2.3.1 La Réaction en Chaîne par Polymérase (PCR)
2.3.2 L’électrophorèse sur gel
3 Enjeux, buts et contraintes des expériences présentées
3.1 Conductivité de l’ADN
3.1.1 Le cadre général : l’électronique moléculaire
3.1.2 Transferts de charges à travers l’ADN : mécanismes et paramètres
3.1.3 Bilan bibliographique
3.2 Mesures de forces sur molécule unique d’ADN et d’ARN
3.2.1 Motivations et selection de travaux antérieurs
3.2.2 Expérience projetée
3.3 Bilans des buts et des contraintes des expériences projetées
4 Micro-manipulation de molécules uniques : montage optique et électronique.
4.1 Micro-manipulation d’une molécule unique
4.1.1 Panorama des techniques existantes : manipulation d’une micro-bille
4.1.2 Principe d’une pince optique[1]
4.1.3 Le double piège optique
4.2 Electroniques de mesures
4.2.1 Mesures de forces
4.2.2 Mesures de conductivités
5 Calibrage et étude des pinces optiques sur une surface opaque
5.1 Calibrage du piège optique
5.1.1 Scan d’une bille fixe sur une surface
5.1.2 Oscillation forcée d’une bille
5.1.3 Analyse du mouvement brownien d’une bille
5.1.4 Variation du coefficient de friction γ en fonction de la température et de
la hauteur z entre le piège optique et la surface de silicium
5.1.5 Conclusions sur les trois techniques de calibrage
5.2 Mesures de forces sur un substrat opaque
5.2.1 Dérives thermiques du système optique
5.2.2 Effets thermiques du laser sur l’échantillon
5.2.3 Variations du calibrage du piège en fonction de la distance entre la bille et
la surface
5.3 Conclusions sur le dispositif expérimental
6 Conclusion

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