Qualité du protéome du spermatozoïde humain et infertilité

LE SPERMATOZOÏDE

La spermatogenèse 

La spermatogenèse est un phénomène dynamique qui débute dans les testicules au moment de la puberté. À cette période, les cordons sexuels se perméabilisent puis se transforment en tubes séminifères. Les tubes séminifères sont constitués par un épithélium composé de 2 populations cellulaires distinctes : les cellules de Sertoli (cellules somatiques), et les cellules germinales à différents stades de division et de différenciation (figure 1). La spermatogenèse se découpe en 3 étapes distinctes : mitose, méiose et spermiogenèse. Elle englobe la totalité des divisions des cellules germinales et du développement des gamètes, de la spermatogonie diploïde (cellule germinale primordiale) au gamète haploïde : le spermatozoïde. La division des cellules germinales débute avec la prolifération par mitose des spermatogonies, situées en périphérie des tubes séminifères sur la membrane basale. Elle progresse en direction de la lumière des tubes, les cellules germinales subissant les 2 divisions méiotiques donnant lieu successivement aux stades intermédiaires de spermatocyte  I (spermatocyte primaire), de spermatocyte II (spermatocyte secondaire) et enfin, de spermatide. La formation du spermatozoïde mature résulte de la différenciation haploïde des spermatides. Cette phase, appelée spermiogenèse, est un processus long et très spécialisé présentant 8 étapes chez l’homme. Au cours de la spermiogenèse, la cellule change de morphologie avec un allongement du noyau. La chromatine nucléaire se compacte de façon à préserver l’intégrité de l’acide désoxyribonucléique (ADN).

Structure générale du spermatozoïde

Le spermatozoïde humain est une cellule hautement spécialisée. Il se compose de 2 parties : une tête et un flagelle (figure 2). Le lien entre la tête et le flagelle est assuré par une pièce connective/collet. La tête, d’une taille de 5 µm par 3 µm, se divise elle même en 2 parties, (1) le noyau dont la chromatine est très condensée par les protamines et (2) l’acrosome, vésicule riche en enzymes indispensables à la fécondation, recouvrant les deux tiers antérieurs du noyau (Auger & Eustache, 2000) (figure 2). Le flagelle est une structure de 60 µm environ qui comprend un axonème central et qui peut être subdivisé en quatre parties : la pièce connective (PC), la pièce intermédiaire (PI), la pièce principale (PP) et la pièce terminale (figure 2).

Le noyau

La chromatine 

La chromatine du spermatozoïde subit un remodelage crucial au cours de la dernière étape de la spermatogenèse, appelée spermiogenèse, qui comprend une élimination en 2 étapes de 90 à 95 % des histones communes à toutes les cellules : remplacement des histones par 2 protéines de transition (T1 et T2), puis par des protamines. Il existe 2 formes de protamines : la protamine 1 (P1) et la protamine 2 (P2). La forme P2 est spécifique des spermatozoïdes humain, murin et équin. Les protamines sont de petites molécules d’environ 17 kDa chargées négativement en raison de la forte teneur en arginine (Ward & Coffey, 1991; Balhorn, 2007; Carrell et al., 2007). Leur pH basique (point isoélectrique supérieur à 11) sert à neutraliser les charges négatives de l’ADN afin de permettre l’hypercompaction de la chromatine. Son déséquilibre engendre une anomalie de compaction de la chromatine, un défaut morphologique de la tête du spermatozoïde et un arrêt du développement embryonnaire. La compaction de la chromatine entraîne une répression quasi complète de la transcription à l’intérieur du spermatozoïde. Un des objectifs de cette compaction est donc de protéger le génome paternel en le rendant inaccessible aux nucléases (Wykes & Krawetz, 2003; Oliva, 2006; de Mateo et al., 2009; Oliva & Castillo, 2011a).

En fin de méiose, une vague d’acétylation induit le recrutement des 2 protéines T1 et T2, l’incorporation des variants testiculaires des histones, une modification des marques épigénétiques et enfin l’intégration d’une proportion égale de P1 et P2 (Brewer et al., 2002; Oliva & Castillo, 2011a). Leur ratio P1/P2 est constant. Une expression anormale des protamines est rare chez les hommes présentant une fertilité normale, mais relativement courante (10 à 20 %) chez les patients souffrant d’une infertilité d’origine masculine (Aoki et al., 2006b). Les niveaux de protamination sont hétérogènes au sein d’un éjaculat. Cependant, des anomalies qui entraînent une mauvaise protamination globale sont habituellement associées à une diminution de la qualité du spermatozoïde, y compris un risque accru de malformations épigénétiques (Aoki et al., 2006a).

La conservation de 5-10 % des histones au cours de la protamination amène à s’interroger sur le rôle biologique potentiel de ces histones résiduelles (Carrell et al., 2007). L’hypothèse que les marquages épigénétiques des histones jouent un rôle dans les fonctions du spermatozoïde normal, peut-être après la régulation du génome paternel après fécondation, a été récemment avancée (Carrell et al., 2016).

L’ARN 

La transcription cesse au cours de la spermatogenèse au stade de spermatide ronde. En effet, aucune activité transcriptionnelle dans le spermatozoïde éjaculé n’a été constatée lors d’expériences d’incorporation d’uridine radiomarquée (Grunewald et al., 2005). Les transcrits d’acide ribonucléique (ARN) sont soit dégradés, soit retenus dans les ribonucléoprotéines pour une utilisation future dans le développement du spermatozoïde ou de l’embryon. Il est démontré que le spermatozoïde contient un pool d’ARN messager (ARNm) pas ou peu traduits, ainsi que de petits ARN non codants (Sendler et al., 2013). Ostermeier et collaborateurs ont été les premiers à rapporter la conservation d’ARN codants et non-codants dans les spermatozoïdes matures (Ostermeier et al., 2005). Cette observation a été confirmée depuis par plusieurs équipes (Carrell et al., 2016), et les types d’ARN identifiés incluent maintenant pratiquement toutes les classes de petits micro-ARN (miRNA), de petits ARN interférents (siRNA), de petits ARN nucléolaires (snoRNA), et ARN interagissant avec piwi (piRNA), ainsi que de longs ARN non-codants (lnRNA) (Sendler et al., 2013).

Grâce aux avancées de la protéomique, des données récentes mettraient pourtant en évidence des protéines ribosomales (de Mateo et al., 2011), ce qui suggérerait une activité traductionnelle probablement restreinte dans le spermatozoïde et aussi une transcription possible dans les mitochondries, comme dans les cellules somatiques (Gur & Breitbart, 2008). D’autres hypothèses divergent : ce pool d’ARNm et de petits ARN non codants serait une réserve d’ARN délivrée à l’ovocyte lors de la fécondation dans le but de soutenir les premières heures de vie du zygote (Kumar et al., 2013). Ainsi, certaines équipes envisagent ce pool d’ARN comme un nouveau marqueur de qualité du spermatozoïde et proposent donc son séquençage (Hamatani, 2011; Li & Zhou, 2012). Par exemple, le miRNA34c a été rapporté comme étant le miRNA le plus abondant dans les spermatozoïdes d’hommes fertiles, mais il a également déjà été signalé comme étant impliqué dans le clivage embryonnaire (Liu et al., 2012).

Le flagelle

Dans la PI et la PP, l’axonème est entouré de fibres denses. Spécifiquement dans la PI, axonème et fibres denses sont recouverts par une gaine composée de mitochondries productrices d’énergie, disposées en hélice. Dans la PP, l’hélice mitochondriale fait place à une gaine fibreuse qui entoure l’axonème et les fibres denses. Le cytosquelette se désorganise progressivement dans la pièce terminale.

La pièce connective 

La pièce connective est une partie courte contenant les colonnes segmentées et qui est le point d’articulation entre la tête du spermatozoïde et le flagelle. À partir des restes du centriole distal, l’axonème se prolonge sur toute la longueur des quatre subdivisions du flagelle pour se désorganiser progressivement dans la partie terminale. L’axonème est constitué d’un anneau de neuf doublets périphériques de microtubules entourant un doublet central (figure 3 et 4). Il s’agit d’une conformation 9+2. Chaque doublet de microtubule est composé d’un tubule A, de treize protofilaments disposés parallèlement, accolé à un tubule B incomplet, soit dix à onze protofilaments. Les protofilaments sont composés d’hétérodimères de α et β tubuline. Par ailleurs, les bras de dynéine internes et externes partent périodiquement de chacun des neuf doublets extérieurs en fonction de la séquence peptidique au niveau du tubule A et sont chargés de générer la force motrice du flagelle (Raff et al., 2008). L’activité adénosine triphosphatasique (ATPasique) de la dynéine est induite par phosphorylation (Turner, 2006). Les bras de dynéine ne sont pas tous activés en même temps, permettant ainsi la courbure du flagelle (figure 5). Ils glissent le long des microtubules, ce qui induit le mouvement périodique et oscillatoire du flagelle. Leur déphosphorylation par une voie dépendante de la calmoduline renverse alors le système. De plus, l’axonème comprend neuf ponts radiaires provenant chacun d’un des neuf doublets de microtubules périphériques, qui se projettent vers le doublet central de façon hélicoïdale (Turner, 2006).

La gaine mitochondriale est composée de mitochondries disposées en hélice (dix à quinze tours de spires) autour de l’axonème (figure 3). Cette hélice mitochondriale intervient à différents niveaux. Son rôle premier est la production énergétique. Le glucose pénètre dans la mitochondrie et intègre 2 voies métaboliques génératrices d’ATP : le cycle de l’acide citrique et la phosphorylation oxydative (Piomboni et al., 2012). Deuxièmement, la mitochondrie est une réserve d’ions calcium (Ca2+) qui est un modulateur de l’hyperactivation du mouvement flagellaire, de la capacitation et la réaction acrosomique (Pereira et al., 2016). Les mitochondries interviennent donc dans la voie métabolique calcique. Enfin, les mitochondries sont les premières pourvoyeuses d’espèces réactives de l’oxygène (ROS pour reactive oxygen species). À certaines concentrations, les ROS sont d’une extrême importance à la fonction des spermatozoïdes (Agarwal et al., 2003; Ford, 2004). À l’inverse une quantité trop importante de ROS conduit à la peroxydation des lipides membranaires, réduisant la fluidité membranaire et la mobilité spermatique. Les ROS peuvent également induire des dommages à l’ADN.

Table des matières

INTRODUCTION
1 LE SPERMATOZOÏDE
1.1 La spermatogenèse
1.2 Structure générale du spermatozoïde
1.3 La tête
1.4 Le flagelle
1.5 La mobilité du spermatozoïde
2 ANALYSES ET SÉLECTION DES SPERMATOZOÏDES
2.1 Analyse des paramètres spermatiques
2.2 Techniques de sélection/préparation des spermatozoïdes
3 LE PROTÉOME DU SPERMATOZOÏDE
3.1 L’approche protéomique
3.2 Le protéome global du spermatozoïde humain
3.3 Le protéome du spermatozoïde humain par compartiments cellulaires
3.4 Le protéome du spermatozoïde chez l’animal
4 LES BIOMARQUEURS PROTÉIQUES DE LA MOBILITE
4.1 Les protéines spermatiques de la mobilité
4.2 Les protéines AKAPs
4.3 La protéine Tau
5 PROTÉOMIQUE DU SPERMATOZOÏDE ET AMP
5.1 Les techniques de l’AMP
5.2 Etudes protéomiques différentielles chez des hommes infertiles et AMP
6 LES OBJECTIFS DE L’ÉTUDE
MATÉRIEL ET MÉTHODES
OBJECTIF 1
Prélèvement de matériel biologique
Analyses morpho-histologiques
Revue de la littérature
OBJECTIFS 2 et 3
Prélèvement de matériel biologique et extraction des protéines
Réalisation du profil du protéome global des spermatozoïdes
Calcul d’un index de qualité du protéome global
Profil d’expression et quantification de la protéine AKAP4
Plan Expérimental de l’étude clinico-biologique du protéome global via le SPQI et de l’AKAP4
comme biomarqueurs potentiels en AMP
TRAVAUX DE THÈSE
Articles 1 & 2
Article 3 en soumission
Brevet d’invention, extention du brevet initial
Article 4 en préparation
DISCUSSION GÉNÉRALE
Etude de la protéine Tau testiculaire et spermatique chez l’homme
La place de la protéomique du spermatozoïde dans l’AMP
Profil protéique spermatique global et protéolyse
Impact de la protéolyse de l’AKAP4 sur la mobilité spermatique
Dégradation tardive versus absence précoce de l’AKAP4, un impact différent
Quel rôle pour la pro-AKAP4 et l’AKAP4 humaines dans la mobilité ?
La protéolyse en lien avec une autre protéine de la mobilité
La place du SPQI et de l’AKAP4 comme biomarqueurs de réussite en AMP
Evaluation statistique des effectifs
La protéomique un bon outil en devenir pour l’AMP
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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