Soutenance mémoire
Depuis des temps anciens, l’Homme s’est toujours intéréssé aux poisons. Bien que conscient du danger présenté par ces derniers, l’Homme a toujours su en tirer profit pour diverses fins, notamment pour la chasse, la pêche, la lutte contre les animaux nuisibles, la guerre, l’élimination des ennemis ou le traitement de certaines maladies. Des travaux de recherche ont montré que de nombreux organismes animaux et végétaux et microbiens élaborent des substances toxiques pouvant avoir une hétérogénéité structurale et des propriétés physico-chimiques très variées. Ces substances communément appelées toxines, une fois introduites dans un organisme vivant, engendrent des pertubations majeures et conduisent souvent à la mort de l’organisme touché. Les connaissances sur les diverses toxines et leur mécanisme d’action n’ont cessé d’être enrichies grâce à la toxicologie, qui est une branche de la science traitant les poisons. L’apport de diverses disciplines scientifiques comme la pharmacologie, la biochimie, la physiologie, la chimie, et la médecine ont permis à la toxicologie de connaître un essor considérable.
MATERIELS
MATERIEL VEGETAL
Classification
Règne : VEGETAL
Embranchement : SPERMAPHYTES
Sous-embranchement : ANGIOSPERMES
Classe : DICOTYLEDONES
Sous-classe : ASTERIDAE
Ordre : GENTIANALES
Famille : APOCYNACEAE
Genre : Pechia
Espèce : madagascariensis
Nom vernaculaire : Tongoborano .
La plante a été identifiée au laboratoire du Parc botanique et zoologique de Tsimbazaza par comparaison à un échantillon d’herbier déposé sous le numéro 13762 par LEEWWENBERG, en 1985.
Description botanique
Description du genre Pechia (MARKGRAF, 1976)
Les représentants du genre Pechia sont des arbustes ou petits arbres. Les feuilles sont persistantes, glabres, verticillées par 3 à 5 sur les rameaux plus forts et souvent par 3 sur les derniers nœuds des rameaux florifères. Elles sont opposées sur les rameaux plus jeunes et sont pourvues de glandes stipiliformes intrapétiolaires et/ou interpétiolaires.
Les inflorescences sont terminales et axillaires, en cymes, bractéolées et glabres. Les sépales sont petits, ovales-triangulaires et brièvement soudés à la base. La corolle est odorante et jaunit rapidement après l’anthèse. Le tube est glabre en dehors et le dedans est poilu. Il est cylindrique et renflé sous la gorge, laquelle est rétrécie en anneau calleux. Plus courts que le tube, les lobes sont oblongs, se recouvrent à gauche et sont non infléchis dans le bouton. L’anthère est aussi oblongue et aiguë, avec un filet court inséré sur le renflement du tube. Les ovaires ont deux loges séparées glabres, ogivales ou coniques qui sont plus longues que le calice et qui renferment des ovules peu nombreux.
Les fruits, de couleur rouge, sont apocarpes, monoliformes et drupoïdes. Chaque article contient son propre endocarpe, lequel est dur et rugueux, incluant une graine ellipsoïdale, aplatie, à testa mince et lisse, et à albumen charnu et non ruminé. L’embryon est droit et à cotylédon ovale oblong.
Description de l’espèce
L’écorce est lisse, souvent fissurée transversalement. Les feuilles sont en verticilles de 3 à 4. Elles sont opposées, simples et entières avec des pétioles de 1 à 15 mm de long. Le limbe est elliptique jusqu’à 23,5 cm × 10,5 cm, avec une base cunéiforme, un apex acuminé et à nervure latérale droite en 15-20 paires.
L’inflorescence est en cyme terminal souvent par groupes de plusieurs portant des fleurs peu nombreuses, lâches. Le pédoncule a 2,5-6 cm de long et les bractées sont aussi longues que les sépales. Les fleurs sont bisexuées et régulières en pentamères, avec un pédicelle de 2 à 11 mm de long. Les sépales sont ovales. La corolle, de couleur vert pâle ou jaune pâle, est munie d’une ceinture de poils au dessous de l’insertion des étamines. Les étamines sont insérées dans la partie supérieure de la corolle. Les ovaires supères sont formés de 2 carpelles distincts, le style est mince et la tête du pistil petite. Les fruits sont composés de 2 follicules cylindriques. Chaque follicule est composé de 1 à 13 drupes de couleur orangée et chaque drupe renferme une seule graine.
Distribution géographique de la plante
Pechia madagascariensis est une espèce endémique de Madagascar. Rencontrée dans les forêts humides sempervirentes près des côtes, elle pousse principalement dans la région Atsinanana (Toamasina), c’est-à-dire aux alentours de Foulpointe, dans la forêt d’Analalava, à Analangavo et dans la forêt du nord du Sihanaka, ainsi que dans la région Sava (Antsiranana), à Nosy Komba.
Date et lieu de récolte
La plante a été récoltée dans la forêt d’Analalava, à 115 km au nord de Toamasina, en Octobre 2007. Elle était au stade végétatif.
Utilisations de la plante
D’après les enquêtes ethnobotaniques auprès des villageois, le décocté de feuilles est utilisé contre les maux de ventre et le rhumatisme. Il est aussi pris comme tonique.
LES PRODUITS CHIMIQUES
Les produits chimiques ainsi que les solvants utilisés sont de qualité pour analyse et de marque MERCK ou PROLABO. Les supports utilisés pour la CCM (chromatographie sur couche mince) sont des plaques de gel de silice 60F254 (marque MERCK) ; de dimensions 20 × 20 cm, l’épaisseur de la couche étant de 0,2 mm. Les plaques peuvent être découpées aux dimensions voulues.
METHODES
PREPARATION ET CONSERVATION DU MATERIEL VEGETAL
Les feuilles sont séchées à l’abri du soleil (à l’intérieur) pendant 2 semaines puis réduites en poudre par une série de broyages à l’aide d’un mixer de marque BLENDER (Robot coupe GT550). La poudre de feuilles ainsi obtenue est conservée dans un bocal hermétique à la température ambiante.
METHODE D’EXTRACTION
Extraction à froid
La poudre de feuilles est mise en suspension dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique 75%) selon le rapport 1/10 (P/V) (10 ml de solvant pour 1g de poudre). Le mélange est soumis à une agitation magnétique durant 3 h à la température ambiante, puis laissé macérer à +4°C pendant une nuit. Le macérat est ensuite filtré sur quatre épaisseurs de gaze après avoir été agité à nouveau pendant 1 h. Le filtrat obtenu est centrifugé à 10 000 tours /min (centrifugeuse JOUAN, T52), pendant 15 min. Le culot est écarté et le volume du surnageant est réduit jusqu’au rapport 1/1 (P/V) (1 ml d’extrait pour 1 g de poudre de feuilles) par évaporation du solvant d’extraction , La solution obtenue constitue l’extrait brut (EB).
Extraction à chaud
La poudre de feuilles est mise en suspension dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique 75%) selon le rapport 1/10 (P/V). Le mélange est chauffé à reflux sous agitation magnétique, à la température d’ébullition du solvant d’extraction pendant 3 h après la tombée de la première goutte. Après refroidissement, l’ensemble est laissé macérer pendant une nuit à +4° C. La suite de la manipulation est identique à celle de l’extraction à froid.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE
1 INTRODUCTION
2 MATERIELS ET METHODES
2.1 MATERIELS
2.1.1 MATERIEL VEGETAL
2.1.1.1 Classification
2.1.1.2 Description botanique de Pechia madagascariensis
2.1.1.2.1 Description du genre Pechia
2.1.1.2.2 Description de l’espèce
2.1.1.3 Distribution géographique de la plante
2.1.1.4 Date et lieu de récolte
2.1.1.5 Utilisation de la plante
2.1.1.6 Les produits chimiques
2.2 METHODES
2.2.1 Préparation et conservation du matériel végétal
2.2.2 METHODES D’EXTRACTION
2.2.2.1 Extraction à froid
2.2.2.2 Extraction à chaud
2.2.3 METHODES DE PURIFICATION
2.2.3.1 Traitement par la chaleur
2.2.3.1.1 Principe
2.2.3.1.2 Mode opératoire
2.2.3.2 Dialyse
2.2.3.2.1 Principe
2.2.3.2.2 Mode opératoire
a) Préparation de la membrane de dialyse
b) Mise en route de la dialyse
2.2.3.3 Traitement par l’acétate d’éthyle
2.2.3.3.1 Principe
2.2.3.3.2 Mode opératoire
2.2.3.4 Traitement par l’acétate neutre de plomb
2.2.3.4.1 Principe
2.2.3.4.2 Mode opératoire
2.2.4 METHODE DE CALCUL DE RENDEMENT
2.2.5 METHODE DE CONCENTRATION
2.2.6 METHODES D’ANALYSE
2.2.6.1 Chromatographie sur couche mince
2.2.6.1.1 Principe
2.2.6.1.2 Mode opératoire
a) Dépôt de l’échantillon
b) Développement de la plaque
c) Révélation du chromatogramme
2.2.6.2. Réaction de détection des familles chimiques
2.2.6.2.1 Les alcaloïdes
a) Test de MAYER
b) Test de WAGNER
c) Test de DRAGENDORFF
2.2.6.2.2 Les flavonoïdes et leucoanthocyanes
a) Les flavonoïdes (test de WILSTATER)
b) Les leucoanthocyanes (test de BATE-SMITH)
2.2.6.2.3 Les tanins et polyphénols
a) Test à la gélatine
b) Test à la gélatine salée
c) Test au chlorure ferrique
2.2.6.2.4 Les anthraquinones (test de BORNSTRÄGER)
2.2.6.2.5 Les désoxyoses (test de KELLER-KILIANI)
2.2.6.2.6 Les irridoïdes
2.2.6.2.7 Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés
a) Test de LIEBERMANN-BURCHARD
b) Test de SALKOWSKI
2.2.6.2.8 Les saponines
3. RESULTATS
3.1 EXTRACTION ET PURIFICATION DES PRINCIPES TOXIQUES
3.1.1 EXTRACTION
3.1.1.1 Extraction aqueuse à froid
3.1.1.2 Extraction hydroéthanolique à froid
3.1.2.1 Extraction aqueuse à chaud
3.1.2.2 Extraction hydroéthanolique à chaud
3.1.2 PURIFICATION
3.1.2.1 Traitement par la chaleur
3.1.2.2 Dialyse
3.1.2.3 Traitement par l’acétate d’éthyle
3.1.2.4 Précipitation par l’ANP
3.2 RENDEMENT
3.3 DEGRE D’HOMOGENEITE DES EXTRAITS
3.4 CARACTERISATION CHIMIQUES
3.4.1 Propriétés physico-chimiques
3.4.2 Nature chimique
4 DISCUSSION ET CONCLUSION
DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE
1 INTRODUCTION
2 MATERIELS ET METHODES
2.1 MATERIELS
2.1.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION
2.1.1.1 Les souris
2.1.1.2 Le sang de mouton
2.1.1.3 Les têtards de grenouille
2.1.1.4 Les alevins de poisson
2.1.1.5 Les larves de moustique
2.1.2 LES VEGETAUX D’EXPERIMENTATION
2.1.3 LES MATERIELS DE MICROBIOLOGIE
2.1.3.1 Les microorganismes utilisés
2.1.3.2 Les milieux utilisés
2.1.3.3 Les disques pour les tests d’antibiogramme
2.2 METHODES
2.2.1 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
2.2.1.1 Test sur souris
2.2.1.1.1 Estimation de la toxicité aigüe
2.2.1.1.2 Détermination de la DL50 (24 h)
2.2.1.2 Test hémolytique
2.2.1.2.1 Principe
2.2.1.2.2 Mode opératoire
2.2.2 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
2.2.2.1 Principe
2.2.2.2 Mode opératoire
2.2.2.2.1 Test sur les têtards de grenouille
2.2.2.2.2 Test sur les alevins de poisson
2.2.2.2.3 Test sur les larves de moustique
2.2.3 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX
2.2.3.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines
2.2.3.2 Eude des effets sur la croissance des jeunes plantules
2.2.3.3 Etude des effets sur les bourgeons axillaires
2.2.4 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LA CROISSANCE DES MICROOGANISMES
2.2.4.1 Techniques de stérilisation
2.2.4.2 Méthodes d’identification des germes
Coloration Gram
a) Principe
b) Mode opératoire
2.2.4.3 Methode d’étude de l’activité antimicrobienne
a) Principe
b) Test d’activité antimicrobienne
2.2.4.4 Détermination de la CMI
3 RESULTATS
3.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX
3.1.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
3.1.1.1 Effets sur les souris
3.1.1.2 Détermination de la valeur de la DL50 (24h)
3.1.1.3 Effets sur les hématies de mouton
3.1.2 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
3.1.2.1 Effets sur les têtards de grenouille
3.1.2.2 Effets sur les alevins de poisson
3.1.2.3. Effets sur les larves de moustique
3.2 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX
3.2.1 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LE POUVOIR GERMINATIF DES GRAINES
3.2.1.1 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES
3.2.1.1.1 Croissance de l’épicotyle et de l’hypocotyle en fonction des conditions de trempage
3.2.1.1.2 Effets de l’extrait brut à différentes concentrations sur la croissance de l’épicotyle et de l’hypocotyle
3.2.3 EFFETS SUR LA CROISSANCE DES BOURGEONS AXILLAIRES
3.3 EFFETS SUR LES MICROORGANISMES
3.3.1 Caractère d’identification morphologique
3.3.2 Activité antimicrobienne de l’extrait brut en milieux solide
4 DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE
