Protocole d’exposition au rayonnement ultra-violet

Protocole d’exposition au rayonnement ultraviolet

Le protocole d’exposition au RUV naturel a été adapté de Boily et al. Trois filtres UV ont été utilisés, soit le J-Roll® utilisé pour bloquer à la fois les UV A et les UVB (filtre sans UV), le Mylar-d® utilisé pour bloquer les UVB seulement(filtre UVA), et en tant que contrôle, le Whirlpak® qui laisse passer aussi bien les RUV que la lumière visible (filtre UV AB). Une toile moustiquaire en fibre de verre noire (Fiberglass screening 30″ x 84″ long, New York Wire) a été ajoutée au-dessus des filtres UV afin d’atténuer de 30 % l’exposition globale des larves au RUV et ainsi en diminuer la mortalité moyenne dans tous les traitements (Boily, 2010).

Protocole d’exposition aux néonicotinoïdes

Dans le but de reproduire les risques d’exposition en conditions naturelles, les formulations commerciales de TMX (Syngenta®) et d’lMl (Bayers®) ont été utilisées. Dans les expériences A et B, les concentrations des NEOCs (0 ng/L- ‘, 8,3 ng/L-‘ et 23 ng/L-‘) ont été choisies de façon à reproduire le dépassement du CV AC (8,3 ng/L-‘). Celles-ci ont été croisées avec trois niveaux de RUV naturel (sans UV, UV A, UV A et UVB). En parallèle, une quatrième concentration de NEOC (132,8 ng/L-‘) en absence de RUVa aussi été testée afin d’augmenter le gradient d’exposition des larves de perchaude aux NEOCS et ainsi, mieux comprendre l’effet du TMX et de 1 ‘lMl en absence de photodégradation. Cette quatrième concentration correspond au critère de qualité de l’eau utilisée par l’Union européenne (140 nglL-‘) (Giroux, 2014). Dans le cas de l’expérience C, quatre combinaisons de concentrations de TMX et/ou d’lMl ont été testées dans le but de reproduire la présence simultanée de NEOCs dans le milieu aquatique au printemps. Avec les trois niveaux de rayonnement UV naturel, les combinaisons de NEOCs étaient: aucun NEOCs, 8,3 ng/L-‘ de TMX, 8,3 ng/L-‘ d’lMl et simultanément, 8,3 ng/L-‘ de TMX et d’lM!.

Expérience A : thiaméthoxame x UV

Les larves de perchaude provenant du LSP ont été exposées à trois concentrations de TMX (0 ng/L-‘, 8,3 ng/L-‘et 23 ng/L-‘) croisées avec trois niveaux de RUV naturel (sans UV, UV A, UV AB) dans 5 blocs complètement randomisés. Une quatrième concentration de TMX (132,8 ng/L-‘) en absence de rayonnement UV a aussi été testée afin d’augmenter le gradient d’exposition des larves de perchaude aux NEOCS et ainsi, mieux comprendre l’effet seul du TMX. Les 10 traitements ont été respectivement reproduits 5 fois. Les larves ont été exposées au rayonnement de 8h à 16 h durant 7 jours. Les changements d’eau ont été effectués en milieu de journée entre Il h et 13 h.

Expérience B : imidaclopride x UV

Les larves de perchaude provenant du LSP ont été exposées à trois concentrations d’IMI (0 ng/L-1 ; 8,3 ng/L- 1 ; 23 ng/L- 1) croisées avec trois niveaux de RUV naturel (sans UV, UV A, UVAB) dans 6 blocs complètement randomisés. Tout comme pour l’expérience A, une quatrième concentration d’IMI (132,8 ng/L- 1) en absence de RUVa été testée afin d’augmenter le gradient d’exposition et de mieux comprendre l’effet de l’IMI en absence de RUV. Les 10 traitements ont été répliqués 6 fois (6 blocs expérimentaux). Dans cette expérience, le nombre de larves ainsi que le nombre de réplicats ont été augmentés afin de maximiser la quantité de tissus de larves pouvant être récoltées à la dernière journée de l’expérience pour la mesure de marqueurs biochimiques. Aussi, contrairement à la première expérience, les larves ont été exposées au RUV sur une plage horaire de 9 h à 17 h plutôt que 8 h à 16 h. La raison de cette modification est que les changements d’eau avec les nouvelles solutions de NEOCs devaient être effectués en début de journée entre 9 h et Il h comparativement à l’expérience précédente où ceux-ci étaient effectués en milieu de journée. II a été observé suite à l’expérience A, que ces changements effectués en milieu de journée, lorsque la température de l’eau et l’indice UV pouvaient être à son maximum. La plage horaire d’exposition a donc dû être changée, tout en considérant suffisamment de temps en début de journée pour permettre pour la préparation des solutions.

Expérience C : thiaméthoxame x imidaclopride x UV

Les larves de perchaude provenant du lac à la Perchaude (Shawinigan, Québec, Canada) ont été exposées à quatre combinaisons de concentration de TMX et/ou d’lMI de façon à reproduire la présence simultanée de NEOCs dans le milieu aquatique au printemps. Les combinaisons de NEOCs étaient: 0 ng/L- 1 , 8,3 ng/L-1 de TMX, 8,3 ng/L-1 d’IMI et 8,3 ng/L-1 de TMX + 8,3 nglL-1 d’IMI. Ceux-ci ont été croisés avec trois niveaux de rayonnement UV naturel (sans UV, UVA, UV AB) dans des blocs complètement randomisés. Les 12 traitements ont été reproduits 5 fois. Les larves ont été exposées au rayonnement UV de 9 h à 17 h durant 4 jours et comme l’expérience B, les changements d’eau ont été effectués en début de journée. Cette expérience, qui était effectuée avec des larves, provenant d’ailleurs qu’au LSP, a été réalisée au mois de juin plutôt qu’en mai. Ce décalage de près de 4 semaines a permis de maximiser le nombre d’expériences pouvant être réalisées avec des larves de perchaude.

Survie et collecte des tissus

Avant le début des expériences et pour chaque jour d’expérimentation, les larves mortes ont été comptabilisées et retirées des incubateurs. Au dernier jour de l’expérience, les larves vivantes ont été euthanasiées à l’eugénol, récoltées et conservées au congélateur à -80 °C jusqu’à l’analyse ultérieure des marqueurs biochimiques.

Dans le cas de l’expérience A, les larves de perchaude ont été placées individuellement sur du papier d’aluminium. Cette méthode de conservation s’est avérée très laborieuse et a causé la déshydratation des larves, rendant les analyses des tissus impossibles.

La méthode de conservation a donc été modifiée pour les expériences suivantes. Ainsi, pour les expériences B et C, les larves ont plutôt été regroupées dans une vial de type Eppendorf® où le maximum d’eau était retiré avec une seringue. Préalablement au transfert dans le congélateur à -80 oC, le poids des larves était noté.

Analyses biochimiques

L’analyse des marqueurs biochimiques a été réalisée seulement pour les expériences B et C, étant donné la méthode de conservation et le nombre insuffisant de larves vivantes à la fin de l’expérience A. Pour réaliser les analyses biochiiques, il était nécessaire d’avoir une quantité minimale de 0,5 g de tissu.

Les tissus ont été homogénéisés avec un Polytron Kinematica PT 1600E Benchtop Homogenizer (Kinematica AG, Bohemia, NY, USA) dans un tampon Low Salt Triton (LST) (lOmM NaCl, 1 %m/v triton X-100, 15 mM NaH2P04, pH 7,3) en respectant la concentration de tissus avoisinant 0,167 g/ml. L’homogénat a été centrifugé à 6000 x g à 4 oC durant 20 minutes. À partir de ce même surnageant, les mesures de l’activité de l’enzyme acétylcholinestérase (AChE), de la peroxydation de lipides (TB ARS) et des protéines ont été réalisées successivement.

La méthode développée par Ellman et al. (1961) a été adaptée pour mesurer l’activité de l’AChE en microplaque (96-puits, microplaque de quartz, Hellma Canada Ltd., Markham, ON, Canada). La réaction a été suivie au spectrophotomètre (i-control 1.9 Microplate Reader Software, Tecan, Morrisville, NC, USA) durant 30 minutes à 412 nm. La différence d’absorbance a été mesurée en soustrayant la valeur obtenue après 10 minutes de celle obtenue à 30 minutes. L’activité de l’AChE a ensuite été rapportée par gramme ou mg de protéines.

La méthode de dosage des substances réagissant à l’acide thiobarbiturique (TBARS) a été adaptée de Camejo et al. (1998) et Hedrei Helmer et al. (2014) en utilisant toutefois le tampon LST (lOmM NaCI, 1 % rn/v triton X-IOO, 15 mM NaH2P04, pH 7,3). Les résultats ont été rapportés par gramme de tissus.

Le dosage des protéines dans les homogénats de larves de perchaude a été déterminé en utilisant le kit BCA de Thermo Fisher Pierce (ThermoScientificTM PierceTM BCA protein Assay, Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada).

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE 1
ÉTAT DES CONNAISSANCES
l.1 Le déclin de la perchaude au Lac Saint-Pierre
1.2 Néonicotinoïdes
1.2.1 Caractéristiques physico-chimiques
1.2.2 Dégradation dans le milieu aquatique
1.2.3 Formation de sous-produits
1.2.4 Détection dans le milieu aquatique
1.2.5 Mécanisme d’ action
1.2.6 Mesure de l’activité de l’acétylcholinestérase
1.2.7 Toxicité chez les organismes non ciblés
1.2.8 Potentiel de bioaccumulation
1.3 Rayonnement ultraviolet
l.3.1 Effets néfastes du rayonnement ultraviolet
1.3.2 Atténuation du rayonnement ultraviolet en milieu lacustre
1.4 Stress oxydatif
1.5 Objectifs et hypothèses
CHAPITRE II
APPROCHES EXPÉRIMENTALES ET MÉTHODOLOGIQUES
2. 1 Collecte, éclosion et transfert des larves de perchaude
2.2 Conditions expérimentales
2.3 Protocole d’exposition au rayonnement ultra-violet
2.4 Protocole d’exposition aux néonicotinoïdes
2.4.1 Expérience A : thiaméthoxame x UV
2.4.2 Expérience B : imidaclopride x UV
2.4.3 Expérience C : thiaméthoxame x imidaclopride x UV
2.5 Survie et collecte des tissus
2.6 Analyses biochimiques
CHAPITRE III
RÉSULTATS ET DISCUSSION 
Abstract
Introduction
Materials and methods
Yellow perch larvae harvesting
Experimental conditions
Experimental design
Larval survival and ti ssue collection
Biochemical analyses
Statistical analysis
Survival analysis
Biomarkers
Results
Environmental conditions during the experiments
Survival analys is
Biomarkers
Discussion
Conclusions
Acknowledgements
Litterature cited
Supplementary material
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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