Protocole de dépistage des porteurs chroniques et détermination de leurs profils sérologiques

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Transmission et populations à risque

Les modes de transmission

Ce sont :
• La transmission parentérale principalement (sang et dérivés) dans les pays développés.
• La transmission par voie sexuelle et salivaire (salive additionnée de sang).
• La transmission mère-enfant, et les accidents d’exposition au sang (AES).
• La transmission du virus est prouvée par l’intermédiaire du sang et des liquides biologiques contenant du sang.
• La transmission du virus par l’intermédiaire du sperme, des sécrétions vaginales et de la salive est possible. Elle est nulle par l’intermédiaire des urines et des selles.
La contagiosité du VHB est liée à :
• sa présence dans la plupart des liquides biologiques des sujets infectés : o le sang (108 à 109 virions/ml)
o le sperme et les sécrétions vaginales (106 à 107virions/mL), o la salive (105 à 107virions/mL)
o et à un titre plus faible dans le lait maternel et les urines [77,7].
• la résistance du virus dans le milieu extérieur et à sa capacité de garder son pouvoir infectieux pendant plus de 7 jours à température ambiante
Selon l’OMS, le virus de l’hépatite B est 50 à 100 fois plus contaminant que le VIH. Quatre modes de transmission sont classiquement identifiés : la voie sexuelle, la voie parentérale, la voie horizontale et la voie périnatale ou verticale [34, 77, 9].
Il est important de préciser que la source de l’infection n’est pas identifiée dans 35% des cas [86].

La transmission périnatale ou verticale

La transmission périnatale de mère atteinte d’une infection chronique à son nouveau-né se produit habituellement au moment de la naissance. La transmission in utéro est relativement rare et représente moins de 2% des infections périnatales dans la plupart des études. Rien n’indique que le VHB se transmet par l’allaitement maternel.
Si une femme est porteuse de l’Ag HBe : il y a 90% de risque que l’enfant soit infecté et devienne porteur, dont 25% mourront de maladie hépatique ; Si l’Ag HBe est négatif : il y a 10 à 20 % de risque de transmission.
La prévalence de l’Ag HBe chez les mères porteuses d’Ag HBs est plus importante en Asie (40%) qu’en Afrique (15%). Les enfants nés de mère Ag HBs positif qui n’ont pas été infectés pendant la période périnatale ont un haut risque d’infection durant l’enfance. Dans une étude, 40 à 60% des enfants né d’une mère Ag HBs positif Ag HBe négatif, ont été contaminés avant 5 ans.

La transmission horizontale

Elle se produit par des contacts étroits avec des porteurs chroniques au sein de la famille ou en collectivité. Elle résulte le plus souvent du contact de lésions cutanées ou muqueuses avec du sang contaminé, ou le partage d’objets tels que brosse à dents, rasoir, etc.

La transmission parentérale

Le VHB peut se transmettre chez les usagers de drogue, par voie intraveineuse ou per-nasale, et lors de l’échange de matériel infecté.
Il peut également être transmis lors de soins, notamment par :
– des injections administrées avec des aiguilles ou des seringues réutilisées sans stérilisation,
– contact des muqueuses avec du matériel souillé insuffisamment décontaminé
– l’administration de produits sanguins dans les pays où aucun dépistage de l’Ag HBs n’est pratiqué sur les dons de sang. Dans les pays développés, malgré les tests, il y a 2 à 16 cas de transmission par million d’unités de sang.
– la chirurgie, et l’hémodialyse
– Le risque professionnel : Ce mode de transmission peut toucher le personnel soignant, lors d’accident d’exposition au sang. On estime que le risque de contamination par piqûre souillée par du sang contaminé varie de 6 à 45% en fonction de la présence ou non de l’Ag HBe dans le sang. En cas d’absence d’Ag HBe, le taux de la virémie permet de déterminer l’infectiosité.
-Les piercings et les tatouages pratiqués sans respect des règles de stérilisation du matériel utilisé, peuvent constituer un mode de transmission d’individu à individu.

La transmission sexuelle

Le VHB se transmet très facilement par des rapports non protégés avec une personne porteuse de l’Ag HBs du VHB.
Le risque de contamination par voie sexuelle peut varier de 30 à 80% et augmente avec : le nombre de partenaires sexuels, les années d’activité sexuelle, les autres IST (Infections sexuellement transmissibles), et le type de rapports notamment les rapports anaux réceptifs

Les marqueurs biologiques de l’hépatite B

Le diagnostic des infections par le VHB se fait par les marqueurs viraux et l’évaluation de la fonction hépatique.
Le bilan initial doit inclure : transaminases (ASAT, ALAT), gamma GT, phosphatases alcalines, bilirubine totale, libre et conjuguée, taux de prothrombine.

Les différents types de marqueurs biologiques

Les marqueurs sérologiques

Ce sont :
 L’antigène HBs est présent dans le sang et les hépatocytes.
 L’antigène HBe est présent dans le sang en même temps que l’Ag HBs. C’est le marqueur sérologique de la réplication virale.
 L’antigène HBc n’est pas décelé dans le sang.
Par contre la présence des anticorps anti-HBc est un marqueur précoce de l’infection (IgM).

Les marqueurs moléculaires

Pour suivre les patients infectés par le VHB, on dispose de plusieurs outils moléculaires :
• la quantification de l’ADN viral plasmatique par PCR,
• la recherche de mutations de résistance aux antiviraux par séquençage lorsque les patients sont traités.
On peut regrouper aussi ces différents marqueurs en deux grands groupes :
LESMARQUEURS DE 1ère INTENTION
*L’Ag HBs est l’antigène de surface du virus qui indique la présence du virus VHB et donc la contagiosité qu’il y ait ou non une réplication virale.
*L’Ac anti-HBs remplace l’Ag HBs lorsque l’hépatite B aiguë évolue vers la guérison ; il traduit également la réponse immunologique à la vaccination.
C’est également un antécédent d’hépatite aigue ayant guéri ou de vaccination efficace (ici, l’Ac anti-HBs est isolé sans AC anti-HBc). Il assure l’immunité en cas de contact avec l’Ag HBs
*L’Ac anti-HBc montre par sa présence un contact antérieur avec le VHB, récent ou ancien sans présager de l’évolution vers la chronicité ou la guérison.
LES MARQUEURS DE 2ème INTENTION
*L’Ag HBe du virus montre une corrélation entre réplication virale et degré d’infection. Il signe la réplication virale (sauf dans le cas particulier du mutant pré-C).
*Les IgM témoignent d’une hépatite aiguë
*Les IgG persistent à vie après le contact.
*L’Ac anti-HBe permet par sa présence de différentier le VHB « sauvage » du « mutant de la région pré-C », il signe l’arrêt de la multiplication virale (sauf dans le cas particulier du mutant pré-C)
*L’ADN du VHB indique la présence du virus, il traduit la multiplication virale.
Plusieurs méthodes sont utilisables pour sa quantification, les plus récentes (PCR= Polymérase Chain Reaction) a abaissé considérablement le seuil de détection.

Les méthodes de détection

Les méthodes utilisant le test d’ELISA

Elles sont commercialisées sous différents noms de marque
*Principe:
La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l’action sur un substrat d’une enzyme préalablement fixée à l’anticorps.
 Le test ELISA indirect
Ce test permet de détecter ou doser des anticorps.
Il se réalise en 4 étapes:
*La première étape appelée « coating » de l’antigène:
Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d’antigène spécifique de l’anticorps recherché.
La fixation de l’antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement. Les plaques sont incubées à 4°C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les antigènes en excès avec du tampon de lavage.
*La deuxième étape consiste à fixer l’anticorps à doser:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d’anticorps à doser pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l’antigène. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de lavage.
*La troisième étape consiste à fixer l’anticorps de détection:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d’anticorps de détection pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se fixent spécifiquement sur les anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en excès avec du tampon de lavage.
Notons que les anticorps de détection sont couplés à une enzyme qui en présence de son substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grâce à l’apparition d’une coloration.
*La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés:
On incube à température ambiante et à l’obscurité pendant 10 minutes, une solution révélatrice contenant le substrat pour l’enzyme. L’apparition d’une coloration dans le substrat indique la présence de l’anticorps à doser. L’intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d’enzyme présent et donc à la concentration d’anticorps recherché.
Exemple d’application:
 Le DAS ELISA direct ou Double Antibody Sandwich ELISA direct
Dans ce cas de figure, l’antigène se trouve entre 2 anticorps spécifiques. L’utilisation de la DAS ELISA nécessite de posséder 2 anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes différents sur l’antigène.
*La première étape consiste à fixer sur le support, l’anticorps de capture. On incube la solution à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.
*Lors de la deuxième étape, on dépose l’échantillon possédant l’antigène à identifier qu’on laisse incuber à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.
*Dans une troisième étape, on fixe l’anticorps de détection marqué avec une enzyme sur l’antigène recherché. Pour cela, on dépose la solution d’anticorps dans les puits puis on incube l’ensemble à 37°C pendant 2 heures.
*La dernière étape, on dépose une solution révélatrice contenant le substrat pour l’enzyme et on laisse incuber pendant 30 à 120 minutes. Le produit de réaction obtenu est soluble et coloré. L’intensité de cette coloration peut être mesurée à l’aide d’un photomètre.
NB: la différence entre le DAS ELISA direct et le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine réside au niveau de l’anticorps de détection. Pour le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine, l’anticorps de détection porte une molécule de biotine qui inter-réagit avec la streptavidine couplée à une enzyme.
Exemple d’application:
La sensibilité du test DAS-ELISA direct se situe entre 1 et 10ng/ml. Cette sensibilité peut être augmentée par l’utilisation du système indirect du fait de la forte affinité entre la streptavidine et la biotine.

Les méthodes utilisant les kits de diagnostic rapide

Ce sont des tests simples et qualitatifs visuels qui permettent de détecter les antigènes et les anticorps dans le sérum ou le plasma humain. Le test est basé sur une technique immuno-chromatographique et donne un résultat dans les 3-5 minutes.
*Principe du test :
L’antigène conjugué de l’or colloïdal est intégré dans le tampon d’échantillon et réagit avec les anticorps anti VHB (ou Ag du VHB) présents dans le plasma ou le sérum.
Il se forme un complexe conjugué or colloïdal/anticorps anti-VHB (ou Ag du VHB). Ce mélange va migrer le long de la bande test, le complexe conjugué or colloïdal /anticorps anti VHB est capturé par un anticorps anti protéine de liaison immobilisée sur une membrane formant ainsi une bande colorée dans la région test. Un échantillon négatif ne produit pas une ligne de test en raison de l’absence de complexes conjugué or colloïdal / anticorps anti-VHB.
Une coloration de la bande de contrôle dans la région de contrôle apparait à la fin de la procédure d’essai quelque soit le résultat du test. Cette bande de contrôle est le résultat du conjugué de l’or colloïdal par la liaison à un anticorps immobilisé sur la membrane. La ligne de commande indique que le conjugué or colloïdal est fonctionnel. L’absence de la bande de contrôle indique que le test est invalide.
*Lecture des tests :
 Résultat positif : Une bande test rouge violacée apparait dans la zone test et la zone de contrôle
 Résultat négatif : une seule bande rouge violacée apparait dans la zone de contrôle.
 Il n’ya pas de signification attribuée à des nuances de couleurs ou de leur intensité pour l’une ou l’autre de la zone test d’essai ou de la zone de contrôle. Il devrait toujours y avoir une bande de contrôle rouge violacée quel que soit le résultat du test. Si elle n’apparait pas, le test est considéré comme nul et à refaire.

Les méthodes utilisant la PCR (Polymerase Chain Reaction)

L’ADN viral a été recherché par amplification génétique selon la méthodologie suivante :
*Principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction)
La Polymérase Chain Reaction (PCR) est une méthode qui permet d’amplifier plus d’un million de fois une séquence particulière d’ADN à partir d’un ADN cible.
L’efficacité et la spécificité de l’amplification dépendent de divers paramètres intervenant dans sa réalisation, à savoir le tampon de réaction, les primers utilisés, les dNTP, l’ADN Template, le type de polymérases ainsi que les paramètres utilisés pour réaliser le cycle des réactions de la PCR.Ainsi, les composants de la solution PCR sont l’ADN cible qui va être amplifié, deux primers ou oligonucléotide spécifiques de deux régions de cet ADN cible, une polymérase thermorésistante qui va copier cet ADN cible à partir des primers et grâce à la présence des quatre bases nucléotidiques à savoir dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
Tous ces éléments une fois mis ensemble vont passer par des cycles de températures au niveau d’un thermocycler. Ce cycle de température est répété entre 25et 40 fois afin de copier l’ADN cible en grande quantité.
Une fois la PCR terminée, on dépose un échantillon de celle-ci sur gel d’agarose en présence de bromure d’ethidium afin de visualiser une bande d’ADN de longueur déterminée par le choix des primers. Le bromure d’ethidium, molécule fluorescente s’intercale au niveau des doubles brins d’ADN et permet donc une visualisation de celui-ci par la lecture sur un banc UV.

Les profils sérologiques des porteurs chroniques du virus de l’hépatite B

Différents types de profils sérologiques peuvent découler de l’infection à VHB, comme nous le verrons ci après :
Seuls trois marqueurs par sérum peuvent être dosés :
Les 3 marqueurs les plus fréquemment demandés sont l’Ag HBs, les Ac anti-HBs et les Ac anti-HBc.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : DONNEES ACTUELLES SUR L’HEPATITE B ET LES MOYENS DE PREVENTION
I. Généralités sur l’hépatite B
I.1 Définition et prévalence de l’hépatite B
I.2 Le virus de l’hépatite B
I.2.1 La particule virale
I.2.2 Le génome du VHB
I.2.3 Le réservoir et sources du VHB
II. Histoire naturelle du virus de l’hépatite B
III.Transmission et population à risque
III.1 Les modes de transmission
III.1.1 La transmission périnatale et verticale
III.1.2 La transmission horizontale
III.1.3 La transmission parentérale
III.1.4 La transmission sexuelle
III.2 Les populations à risque de transmission
III.3 Les groupes à risque ou populations exposées
IV. Les marqueurs biologiques de l’hépatite B
IV.1 Les différents types de marqueurs biologiques
IV.1.1 Les marqueurs sérologiques
IV.1.2 Les marqueurs moléculaires
IV.2 Les méthodes de détection
IV.2.1 Les méthodes utilisant le test d’ELISA
IV.2.2 Les méthodes utilisant les kits de diagnostic rapide
IV.2.3 Les méthodes utilisant la PCR
V. Les profils sérologiques des porteurs chroniques du virus de l’hépatite B30
VI. La prévention de l’hépatite B
VI.1 Les mesures vaccinales
VI.1.1 Les types de vaccins
VI.1.2 Les indications de la vaccination
VI.1.3 Les contre-indications de la vaccination
VI.1.4 Le schéma vaccinal et le mode d’administration
VI.1.5 Le suivi vaccinal
VI.1.6 La réponse à la vaccination
VI.1.6.1 Réponse à la primo-vaccination
VI.1.6.2 Facteurs de non réponse
VI.1.7 Les effets indésirables
VI.1.8 Le rapport bénéfice/risque
VI.2 Les mesures non vaccinales
VII. Prise en charge d’un porteur chronique de l’Ag HBs
VII.1 Cas des transaminases normales
VII.2 Cas des transaminases élevées
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL DE RECHERCHE
I. Le contexte de l’étude
II. Le cadre de l’étude
III. Les objectifs de l’étude
III.1 Objectif général
III.2 Objectifs spécifiques
IV. Méthodologie
IV.1 Le type d’étude
IV.2 La période d’étude
IV.3 L’équipe de recherche
IV.4 La population étudiée
IV.5 Information et consentement des participants
IV.6 Collecte des informations
IV.7 Dépistage des porteurs chroniques
IV.8 Immunisation des étudiants
V. Matériels et méthodes d’analyses
A/ Protocole de dépistage des porteurs chroniques et détermination de leurs profils sérologiques
A.1 Les prélèvements
A.2 Méthodes d’analyses
B/ Protocole de vaccination
B.1 Les vaccins
B.2 Le schéma vaccinal et technique de vaccination
TROISIEME PARTIE : RESULTATS
I.Les principales caractéristiques de la population d’étude
II. Les principales caractéristiques des non participants
III. Prévalence de l’hépatite B chronique dans la population d’étude.
IV. Résultats du profil des porteurs chroniques
V. Résultats des actions de prévention
V.1 Résultats de la vaccination
V.2 Mesures de réduction des risques de transmission
V.3 Suivi des porteurs chroniques non éligibles à un traitement
V.4 Traitement des porteurs chroniques éligibles à un traitement
V.5 Dépistage et vaccination de l’entourage des porteurs chroniques.85
QUATRIEME PARTIE : COMMENTAIRES ET DISCUSSIONS
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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