Soutenance mémoire
Préambule
Les organismes aquatiques font face à des stress complexes liés aux fluctuations abiotiques classiques du milieu et à l’anthropisation, auxquels se superpose la problématique du changement climatique. Cela impose le développement de nouveaux outils de biosurveillance permettant de suivre la qualité des milieux aquatiques. Il s’agit d’augmenter la palette des biomarqueurs existants pour répondre aux attentes réglementaires et sociétales de la DCE et de la DCSMM, en s’appuyant sur l’utilisation de batteries de biomarqueurs plutôt que sur des marqueurs isolés.
La recherche de ces biomarqueurs nécessite en amont l’identification des mécanismes et des acteurs moléculaires associés à un stress donné. Afin de mettre en évidence les acteurs protéiques les plus fréquemment sollicités, les redondances dans les réponses moléculaires à différents stress d’espèces sentinelles bivalves ont été compilées dans un ensemble de données rassemblant l’analyse de protéomes branchiaux issues d’études indépendantes couvrant la période 2008-2018. Le travail présenté ici est une méta-analyse de données de protéomique précédemment acquises au sein du laboratoire d’accueil. L’approche protéomique est une approche ouverte et globale qui cible directement les effecteurs cellulaires et reflète non seulement l’expression génique mais tient également compte des régulations post-transcriptionnelles et post-traductionnelles.
La stratégie repose sur une ré-exploitation de données in silico et ne comporte pas d’approche expérimentale au sens classique du terme. Le jeu de données est issu de 8 expérimentations en condition de stress thermiques ou chimiques chez les bivalves. Pour chaque expérimentation, les variations d’abondance relatives entre conditions contrôle et exposée sont déjà établies et les spectres de masse disponibles. Le matériel utilisé dans ce travail de thèse inclut des ensembles d’analyse protéomique avec les images de gels, les tableurs d’analyse statistique, les fichiers de spectrométrie de masse. L’hypothèse est que la méta-analyse fera apparaître des récurrences de réponse chez les moules quels que soient les stress imposés et mettra ainsi en évidence des acteurs communs. Ce set d’acteurs constitue une source de candidats dans la recherche de biomarqueurs pour la surveillance environnementale.
Contexte écotoxicologique
La pollution des milieux aquatiques représente l’un des principaux problèmes environnementaux du XXIème siècle. Les conséquences de l’urbanisation côtière, des activités industrielles et agricoles, la production et la consommation de substances chimiques ont entraîné le rejet de milliers de polluants dans les cours d’eau et, in fine, dansles milieux marins. A ces contaminations, se surajoutent désormais les effets du changement climatique. La dégradation des milieux aquatiques (acidification océanique, fonte des masses glacières arctiques et antarctiques, élévations du niveau de la mer, chute de la biodiversité) a généré une prise de conscience scientifique, politique et sociale de la fragilité et de l’importance des milieux aquatiques et de la nécessité de les protéger. Dès 2014 dans son 5ème rapport, le GIEC (Groupe d’experts Intergouvernemental sur l’Evolution du Climat) alertait sur les risques liés à l’anthropisation de ces milieux. En 2021, le GIEC concluait d’ailleurs que le climat change partout dans le monde et plus rapidement que prévu, ce qui se traduit par des évènements climatiques extrêmes d’ores et déjà plus sévères et plus fréquents (IPCC, 2007, 2014, 2022).
Biosurveillance – aspects réglementaires
A l’échelle mondiale, la protection des ressources en eaux et des milieux aquatiques s’appuie sur l’élaboration de conventions multilatérales qui permettent de définir des objectifs et des stratégies communs aux pays signataires. A titre d’exemple, la Convention de Barcelone (1976) protège la zone méditerranéenne ; amendée en 1995, elle sera rebaptisée Convention pour la protection du milieu marin et du littoral de la Méditerranée. La Convention OSPAR (« Oslo-Paris », 1992) quant à elle, s’attache aux modalités de la coopération internationale pour la protection du milieu marin de l’Atlantique Nord-est. Enfin, la Convention de Stockholm (2001) cible plus spécifiquement certains polluants organiques persistants majeurs, souvent appelés « the dirty dozen » et interdit leur usage dans les pays signataires ; elle sera amendée en 2009 et la liste des composés proscrits élargie à cette occasion. Les problématiques de gestion de l’eau et de restauration de sa qualité ont amené la France à adopter dès 1964 la loi sur l’eau qui organise la gestion de l’eau par bassin versant avec la création des agences de l’eau et des comités de bassin. Les principaux textes qui régulent aujourd’hui les usages de l’eau et la protection des milieux aquatiques sont portés par la Commission Européenne puis transposés en droit français. Ils concernent la préservation de l’eau et de l’environnement, la régulation de la production de substances chimiques ou encadrent le suivi sanitaire des espèces aquatiques destinées à la consommation humaine (Eau France, https://www.eaufrance.fr/lesprincipaux textes-en-vigueur).
La Directive Cadre sur l’Eau (DCE, 2000/60/CE) est considérée comme un texte fondateur au niveau européen. Elle a été transposée en droit français en 2006 avec la loi sur L’Eau et les Milieux Aquatiques (LEMA, 2006-1772). La DCE a mis en place une politique globale pour atteindre un « bon état écologique et chimique» des masses d’eau en Europe et développer une utilisation durable et équitable des ressources en eau. Elle concerne les eaux souterraines et superficielles (eaux douces et eaux côtières) et s’appuie sur une gestion par grands bassins hydrographiques. Après une phase permettant d’établir un état des lieux pour chaque bassin, un schéma directeur d’aménagement et de gestion des eaux (SDAGE) est établi pour définir et prioriser les actions à mettre en place par cycle de 5 ans. La DCE ambitionne également de réduire les émissions et rejets depolluants dits prioritaires du fait de leur dangerosité. La liste des substances concernées comprenait initialement 33 molécules et est régulièrement révisée (45 composés actuellement).
En 2008, la Directive Cadre sur l’Eau est mise à jour (2008/105/CE) et impose de nouvelles normes de qualité environnementale pour les substances prioritaires et certains autres polluants. Elle fixe en outre 2027 comme date butoir pour atteindre le bon état des masses d’eau. La Directive Cadre Stratégie pour le Milieu marin 2008/56/CE (DCSMM) est mise en œuvre sur le même schéma que la DCE. Son objectif est d’amener les eaux marines à un bon état écologique à l’horizon 2026. Elle se décline à l’échelle de régions marines et comprend des étapes d’évaluation et de définition des objectifs environnementaux suivies par la mise en place de programmes de surveillance à travers un Plan d’Action pour le Milieu Marin (PAMM). La DCSMM s’appuie sur des réseaux de surveillance préexistants comme le Réseau d’Observation de la Contamination Chimique (ROCCH) de l’Ifremer qui a succédé au Réseau National d’Observation, RNO, fondé en 1974.
Les zones marines de production professionnelle de coquillages font l’objet d’un suivi sanitaire spécifique, initialement défini par la règlementation 2004/854/CE qui organise le contrôle des produits d’origine animale destinés à la consommation humaine Ce texte a été renforcé par l’arrêté ministériel du 6 novembre 2013 (Légifrance, NOR : AGRG1322935A) qui intègre les évolutions réglementaires au niveau européen. Il impose la mise en place d’échantillonnages réguliers de bivalves avec suivi de la qualité microbiologique, recherche de phycotoxines et dosage des polluants. En outre, un inventaire des sources de pollution pour les différents sites a été créé. En France, le suivi est assuré par Ifremer à travers les réseaux de surveillance REMI (microbiologie), REPHYTOX (phycotoxines).
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Table des matières
Introduction
I. Préambule
II. Contexte écotoxicologique
II.1. Biosurveillance – aspects réglementaires
II.2. Biomarqueurs
II.2.1. Historique et définition
II.2.2. Limites de l’utilisation des biomarqueurs
II.2.3. Apport des omiques
III. Modèles biologiques
III.1. Phylogénie des mollusques bivalves
III.1.1. Lophotrochozoaires
III.1.2. Mollusques aquatiques
III.1.3. Bivalves
III.2. Présentation des 2 modèles biologiques utilisées
III.2.1. Mytilus sp
III.2.2. Dreissena sp
IV. Approche protéomique
IV.1. Les stratégies d’analyse protéomique
IV.1.1. Extraction
IV.1.2. Décomplexification
IV.1.3. Identification par spectrométrie de masse
IV.2. Etat de l’art protéomique Mytilus et Dreissena
V. Stress et réponses au stress
V.1. Le stress cellulaire
V.2. La réponse cellulaire au stress
Objectifs
Matériel et Méthodes
I. Matériel
I.1. Description des expérimentations
I.1.1. Expérimentations sur les moules bleues
I.1.2. Expérimentations sur les dreissènes
I.2. Description des analyses 2DE
I.2.1. Préparation des échantillons
I.2.2. IEF : première dimension
I.2.3. SDS PAGE : deuxième dimension
I.2.4. Coloration au bleu colloïdal
I.2.5. Analyse d’images et traitement statistique
I.3. Spectrométrie de masse
I.3.1. Techniques de spectrométrie de masse
I.3.2. Fichiers de masse
I.3.3. Banques de données pour l’analyse des spectres de masse
I.4. Récapitulatif des données disponibles
II. Méthodes
II.1. Procédure d’identification des spectres de masse
II.1.1. Mascot
II.1.2. X !Tandem
II.2. Autres outils d’analyses omiques
II.2.1. Outils génériques
II.2.2. Informations d’identité
II.2.3. Informations de structure
II.2.4. Les sites de clivages protéolytiques
II.2.5. Les interactions protéines-protéines
II.2.6. Les banques de données des multitâches
II.3. Synthèse de la procédure suivie
Résultats & Discussion
Conclusion
