Protéines : Structure, dynamique et fonction

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Modifications post-traductionnelles

Grâce à leur grande accessibilité, les IDPs sont une cible privilégiée des PTMs. Ces PTMs peuvent également être rapidement retirées43, permettant ainsi une fine régulation des processus biologiques. Différents types de PTMs sont observés sur les IDPs : soit l’ajout de groupements chimiques (glycosylation, acetylation, phosphorylation, etc), soit l’ajout d’une petite protéine (sumoylation, ubiquitinylation).
Les PTMs influent sur la protéine cible de différentes manières. Premièrement, l’ajout d’un groupement chimique modifie la structure primaire de la protéine. Ceci entraîne la modification des propriétés chimiques de l’acide aminé, comme l’ajout de charges lors d’une phosphorylation, ou au contraire la neutralisation de charges lors d’une acétylation. Les IDPs peuvent comporter une, plusieurs, ou une combinaison de différentes PTMs. Ceci permet de déclencher des mécanismes d’amplification ou de compétition pour une régulation fine du signal porté par l’IDP. Une seconde manière de moduler l’activité d’une IDP via une PTM est de permettre la stabilisation ou non de structures secondaires résiduelles44. Enfin, une PTM peut permettre le rapprochement ou l’éloignement de résidus éloignés dans la séquence en induisant un changement de la structure tridimensionnelle de l’IDP, comme dans le cas de la protéine p27 qui se lie au complexe Cdk4/cycline D dans une conformation ouverte et qui, grâce à la phosphorylation de sa tyrosine 88, adopte une conformation fermée qui entraîne la levée de l’inhibition du complexe Cdk4/cycline D45.
Enfin, l’ajout d’un groupement chimique peut entraîner une stabilisation ou une déstabilisation locale de la structure de la protéine, lui permettant de passer d’un état désordonné à un état structuré46–49, ou de s’auto-associer pour former des structures complexes de type fibrilles49 ou des transitions de phase50, ou encore d’interagir avec un partenaire22.
La PTM la plus fréquente est la phosphorylation. Il est estimé qu’environ un tiers des protéines eucaryotes pourraient être phosphorylées, et la plupart des phosphorylations se situent dans des IDRs37,51. Cette modification consiste en l’ajout d’un groupement phosphoryl tétraédrique portant deux charges négatives à la place d’une fonction hydroxyle. Le groupement phosphoryl permet de nouvelles interactions électrostatiques grâce aux deux charges négatives présentes, mais également des liaisons hydrogènes supplémentaires grâce aux atomes d’oxygènes ajoutés. Par ailleurs les sérines phosphorylées ont un rôle stabilisateur d’hélice lorsqu’elles sont situées en N-terminal d’une hélice tandis qu’elles peuvent déstabiliser une telle structure si la phosphorylation est positionnée au coeur ou en C-terminal de l’hélice . De plus, les IDPs possédant des sérines et des thréonines phosphorylées ont été montrées comme interagissant avec différents domaines fréquemment retrouvés dans les protéines, tels que les domaines SH2, WW, WD40 et BRCT53. Ainsi, la phosphorylation des IDPs permet d’accroitre drastiquement les possibilités d’interaction avec d’autres partenaires protéiques. De la même manière, l’acétylation des lysines des IDPs ainsi que la méthylation des arginines leur permet d’interagir avec les protéines à domaines Bromo54 et Tudor55, respectivement.
Les histones sont des protéines impliquées dans la compaction de l’ADN, elles forment le nucléosome autour duquel s’enroule l’ADN. Les histones font partie des protéines ayant des IDRs et dont les PTMs entraînent des changements flagrants de comportement vis-à-vis de leurs partenaires. En effet, les queues N-terminale et C-terminale des histones sont dépliées et sont le siège de nombreuses PTMs. Ces PTMs ont un rôle central dans la régulation de l’accessibilité de l’ADN au sein de la chromatine56. Par exemple l’acétylation des lysines des queues des histones neutralise la charge positive de la lysine acétylée et modifie l’interaction de l’histone à la molécule d’ADN chargée négativement57. Comme dit précédemment, les acétylations et méthylations de certains résidus des histones permettent la liaison de protéines possédant des domaines Bromo et Tudor. Il se trouve que de nombreuses protéines impliquées dans les complexes de remodelage de la chromatine possèdent ce type de domaine. Les PTMs peuvent agir sur le recrutement de ces complexes de remodelage de la chromatine et entraîner localement la compaction ou non de l’ADN, régulant ainsi l’expression des gènes.
Certaines PTMs favorisent également l’ancrage de protéines non membranaires ayant des régions désordonnées à des membranes phospholipidiques. En effet, l’ajout de groupements myristate, palmitate, isoprénoides, glycosylphosphatidylinositol58 ou encore farnésylpyrophosphate, contribuent à la relocalisation des IDPs et à leur ancrage à la membrane.

Auto-assemblage et agrégation

Une caractéristique très intéressante des IDPs est leur capacité à s’auto-associer. Cette propriété leur vient de la faible complexité de leur séquence en acides aminés. De plus en plus d’IDPs étant capables de s’assembler en des structures complexes sont découvertes. Ces auto-assemblages sont parfois fonctionnels59. Ils peuvent également entraîner la survenue de pathologies.
Par exemple, l’-synucléine, une protéine cytosolique désordonnée, exprimée dans les cellules neuronales humaines, est capable de s’associer de manière réversible à des lipides pour stabiliser une conformation en hélice60. Malheureusement, il arrive que cette association avec des lipides entraîne un défaut de structuration et que la protéine s’agrège en formant des fibres riches en feuillets . Ces agrégats sont les principaux composants des corps de Lewy, associés à des maladies diverses appelées synucléopathies, telle que la maladie de Parkinson62. La fibrillation de type amyloïde de l’-synucléine est donc un comportement pathologique de la protéine. Le même phénomène survient avec le peptide A-40 dans le cadre de la maladie d’Alzheimer.
Pour autant, toutes les formes de fibres amyloïdes ne sont pas pathogènes, il a d’ailleurs été montré que de nombreuses protéines sont capables, si elles se trouvent dans les conditions adéquates, de former des structures de type amyloïde63. Par exemple, la protéine Pmel17 s’associe en fibres amyloïdes de manière à accélérer la formation de mélanine dans les cellules de mammifères64.
Très récemment, différentes études ont montré que les IDPs étaient capables de s’auto-assembler pour former des organelles sans membrane65. Ces transitions de phase jouent de nombreux rôles et de plus en plus d’équipes démontrent leur importance dans des mécanismes de régulation divers et variés. Elles sont observées lorsque deux espèces chimiques distinctes se repoussent en étant diluées dans un milieu aqueux66. De cette manière, les protéines impliquées dans ces transitions de phase se trouvent dans un état d’énergie libre inférieure à celle de leur état monomérique en solution67. Les premières transitions de phase résultant de l’association de protéines entre elles ont été mises en évidence en conditions de stress. En effet, ces conditions de stress entraînent un mauvais repliement des protéines et ainsi un auto-assemblage qui aboutit à la formation d’une particule protéique de haut poids moléculaire68.
Une caractéristique commune aux protéines formant des transitions de phase est la présence de régions riches en répétitions d’acides aminés polaires (glycines, glutamines, asparagines et sérines), apolaires (proline), positivement chargés (arginine, lysine), négativement chargés (aspartate, glutamate), aromatiques (tryptophane, phénylalanine, tyrosine). Par contre, les acides aminés aliphatiques et hydrophobes sont très peu représentés. Il semble que les protéines impliquées dans les transitions de phase restent désordonnées au sein des organelles69,70.
Les transitions de phase sont des phénomènes très sensibles aux conditions physico-chimiques du milieu extérieur. Comme détaillé précédemment, les modifications post-traductionnelles peuvent avoir une influence sur la capacité d’une protéine à former de telles structures. Cependant, une variation de la température, de la concentration en sel ou de la concentration locale de la protéine impliquée dans les transitions de phase permet également de moduler la survenue de ce phénomène. Par exemple, il a été montré que les granules formés par le domaine « low-complexity » de la protéine FUS (RNA-Binding Protein FUS, également nommée « Fused in Sarcoma » ; Figure 6) se dissipent avec l’augmentation de la température, mais qu’ils ont une plus forte tendance à se former lorsqu’on augmente la concentration en sel et également la concentration locale en FUS69. Récemment, il a également été montré que la protéine FUS n’est plus capable de réaliser ce type de structure lorsque le résidu arginine du troisième motif « RGG » est méthylé71. Figure 6 : Influence des conditions physico-chimiques sur les transitions de phase observées avec le domaine « low complexity » (LC) de la protéine FUS avec ou sans coupure de son étiquette de purification69. (A) : Image de microscopie par interférences différentielles montrant la formation de transitions de phase par le domaine LC de FUS à haute concentration (gauche) mais pas à faible concentration (droite). (B) : Images de microscopie par interférence différentielles montrant la formation de transitions de phase par la protéine FUS entière après coupure de l’étiquette MBP grâce à la protéase TEV (gauche) mais pas lorsque l’étiquette est présente (droite). (C) : Diagramme montrant par densité optique la capacité du domaine LC de FUS à former des transitions de phase en fonction de la température et de la concentration en protéine. Ces tests ont été réalisés à différentes concentrations de NaCl. (D) : Après coupure de l’étiquette MBP avec la protéase TEV, la concentration en NaCl ne modifie pas la capacité de la protéine FUS entière à former des transitions de phases. Une concentration en NaCl supérieure à 150 mM diminue tout de même ce phénomène.
Les transitions de phase ont souvent été associées à des pathologies, par exemple la cataracte est une pathologie entraînant un changement d’état des protéines du cristallin d’un état clair à une phase opaque, empêchant le passage de la lumière. Par ailleurs, les transitions de phase peuvent évoluer et former des hydrogels72 dérivant vers une polymérization de type amyloïde73. Enfin, récemment, une équipe a suggéré que la formation de transitions de phase par la protéine Tau est une des prémices de l’agrégation de la protéine observée dans la maladie d’Alzheimer50.
Cependant, de plus en plus d’études suggèrent que ces transitions de phase liquide-liquide peuvent être fonctionnelles et nécessaires74. Notamment, une équipe a étudié la dynamique des granules P au sein des corps riches en ARN. Les granules P montraient une capacité à fusionner entre eux en adoptant un état de transition de phase liquide-liquide75. Différents rôles ont été mis en évidence pour de telles structures. On leur attribue en effet la capacité de se lier à des acides nucléiques75, à des protéines associées à l’ARN76, de servir de cargos protéiques pour permettre une traduction localisée d’un ARNm77 ou encore d’augmenter la concentration locale des protéines impliquées69.
Enfin, les protéines désordonnées sont également source de nombreux challenges lors de leur étude. Lorsque leur concentration est trop importante, les contacts défavorables s’amplifient et une agrégation aspécifique de la protéine est alors observée. L’encombrement cellulaire peut également être une source de contacts défavorables et le repliement d’une protéine peut être vu comme une stratégie de la cellule visant à maintenir une protéine soluble78. Par ailleurs, les IDPs étant particulièrement accessibles au solvant, elles encourent un risque accru d’oxydation, entraînant la formation de ponts disulfures non natifs intra- ou intermoléculaires pouvant mener à de l’agrégation. De la même manière, leur accessibilité au solvant accroit le risque de dégradation par des protéases. Une IDP dégradée peut alors se comporter différemment de la protéine native et ce phénomène peut promouvoir l’agrégation anarchique de la protéine. D’extrêmes précautions sont donc nécessaires lorsqu’une étude structurale sur des protéines dépliées doit être menée.

Rôles

Les IDPs sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires. Dans cette partie je vais m’intéresser plus particulièrement aux IDPs impliquées dans la régulation de la transcription des gènes, dans le remodelage de la chromatine ainsi que dans la signalisation cellulaire. Je vais détailler plusieurs exemples de protéines en montrant leur impact dans les rôles biologiques précités.

Les protéines désordonnées impliquées dans la régulation de la transcription des gènes

L’interaction du facteur de transcription HIF1- (Hypoxia Inducible Factor 1-) avec CBP/p300 est une bonne illustration de l’importance des régions désordonnées dans la régulation de la transcription des gènes. En effet, la protéine CREB Binding Protein (CBP) ainsi que son paralogue p300 sont des co-activateurs transcriptionnels. Ils possèdent une fonction histone-déacétylase leur conférant un rôle potentiel dans le remodelage de la chromatine mais également dans la modification de facteurs de transcription. Par ailleurs, ils possèdent la capacité d’agir comme chaperonne en recrutant un ensemble de protéines impliquées dans la machinerie de transcription. Le facteur de transcription HIF1- se lie au domaine TAZ1 de CBP/p300 et régule ainsi la réponse à l’hypoxie79. Le facteur HIF1- est désordonné lorsqu’il est sous forme libre. Lors de son interaction avec CBP, il adopte une structuration en hélice  et s’enroule autour de CBP, créant ainsi une surface d’interaction de très grande taille, menant à une affinité très importante de 7 nM80,81, une affinité qui ne pourrait pas être atteinte si cette interaction était effectuée avec des protéines structurées de tailles similaires. Ce mode de liaison illustre parfaitement la compensation enthalpie-entropie caractéristique des protéines désordonnées.

Les protéines désordonnées jouant un rôle dans le remodelage de la chromatine

Les histones H1 sont impliquées dans la compaction de la chromatine. Elles se fixent à la surface externe du nucléosome, près du point d’entrée/sortie de l’ADN82. Les histones H1 ont trois domaines distincts : un domaine N-terminal de 20 à 35 acides aminés, un domaine globulaire central d’environ 80 acides aminés ainsi qu’un long domaine C-terminal d’environ 100 acides aminés83. Les domaines terminaux sont intrinsèquement désordonnés et se structurent lors de la liaison à l’ADN84–86. Le domaine C-terminal déplié de H1 est impliqué dans la condensation de la chromatine via son association à l’ADN et la neutralisation des charges situées sur l’ADN87. H1 est phosphorylée au cours du cycle cellulaire par des kinases dépendantes des cyclines (CDKs) sur des séquences consensus (S/T)-P-X-(K/R). Le niveau de phosphorylation est au plus bas en phase G1, puis augmente au cours des phases S et G2 pour être maximal en métaphase, ce niveau décroît ensuite rapidement88,89. La phosphorylation partielle du domaine C-terminal de H1 réduit considérablement la capacité de la chromatine à s’agréger et empêche ainsi la formation d’assemblages d’ordres supérieurs. La phosphorylation complète permet de restaurer cette capacité. Ainsi H1 est peu phosphorylée en interphase avec une chromatine relâchée et est hyperphosphorylée durant la métaphase avec une chromatine condensée. Le phénomène menant à un relâchement de la chromatine peut s’expliquer par le fait qu’une phosphorylation partielle du domaine C-terminal déplié de H1 entraîne une augmentation de structure ainsi qu’une diminution des hélices  et des boucles (données de spectroscopie infra-rouge90). La diminution du potentiel électrostatique du domaine C-terminal déplié de H1 proviendrait de sa structuration en feuillet . En effet, 70% des lysines du domaine C-terminal de H1 sont en doublet qui seraient projetées dans des directions opposées dans le feuillet . Ceci entraînerait une diminution d’affinité lors de l’interaction avec l’ADN91, et donc une chromatine moins condensée.

Protéines désordonnées impliquées dans la signalisation cellulaire

La protéine p120 est un exemple de protéine jouant un rôle dans la signalisation cellulaire en intervenant dans l’adhésion cellule-cellule. En effet, p120 se lie à la queue désordonnée cytoplasmique des cadhérines92. La région coeur de la queue des cadhérines apporte la spécificité à cette interaction et se lie très fortement à p120 grâce à une interface structurée statique. Par contre, une région N-terminale flanquante interagit faiblement et de manière dynamique avec p120 en créant des fluctuations entre les états libre et lié. Si cette interaction dynamique contribue peu à l’affinité de la liaison, elle joue un rôle essentiel dans la détermination de l’avenir cellulaire des cadhérines en masquant un motif leucine-leucine qui est nécessaire pour démarrer l’internalisation par endocytose médiée par les clathrines.
Un second exemple de protéines intrinsèquement désordonnées ayant une fonction de signalisation est celui des kinases RIP1 et RIP3 (pour Receptor Interacting Protein Kinase). Ces deux dernières s’assemblent pour former un complexe de signalisation requis pour la nécrose programmée qui est une fibrille amyloïde hétérodimérique93. La formation de cette fibrille est médiée par de courtes séquences amyloidogéniques RHIM (RIP homotypic interaction motif), situées dans des régions intrinsèquement désordonnées de RIP1 et RIP3. Il a été suggéré que les séquences RHIM sont cachées dans l’état inactif et deviennent exposées lors de la formation du nécrosome (sous forme de fibrille amyloïde), ce qui permet l’activation de ces kinases par phosphorylation93.

Table des matières

I. Introduction
I.1. Protéines : Structure, dynamique et fonction
I.1.1 Le dogme fondamental structure-fonction des protéines
I.1.2 Les protéines intrinsèquement désordonnées
I.1.2.1. Spécificités et structure
I.1.2.2. Modifications post-traductionnelles
I.1.2.3. Auto-assemblage et agrégation
I.1.2.4. Rôles
I.1.2.4.1 Les protéines désordonnées impliquées dans la régulation de la transcription des gènes
I.1.2.4.2 Les protéines désordonnées jouant un rôle dans le remodelage de la chromatine
I.1.2.4.3 Protéines désordonnées impliquées dans la signalisation cellulaire
I.2. Enveloppe nucléaire
I.2.1 Présentation générale de l’enveloppe nucléaire
I.2.2 Les protéines ancrées à l’enveloppe nucléaire
I.2.2.1. L’émerine
I.2.2.1.1 Auto-assemblage de l’émerine
I.2.2.1.2 Interaction émerine-BAF
I.2.2.2. SUN1 et le complexe LINC
I.2.2.2.1 Auto-assemblage des protéines à domaine SUN et interaction avec les protéines à domaine KASH
I.2.2.2.2 Interaction entre SUN1 et la lamine A
I.3. La Lamina nucléaire
I.3.1 La lamine A
I.3.1.1. Structure
I.3.1.2. Fonctions
I.3.1.2.1 Rôles de la lamine A dans la signalisation cellulaire
I.3.1.2.2 Implications de la lamine A dans la régulation de la transcription
I.3.1.2.3 Rôle de la lamine A dans le remodelage de la chromatine et le maintien de la structure du noyau
I.3.1.3. Modifications post-traductionnelles
I.3.1.3.1 Régulation de la lamine A par phosphorylation
I.3.1.3.2 La farnésylation de la lamine A
I.3.2 Les pathologies associées à l’émerine, SUN1/2 et la lamine A/C
I.3.3 Une pathologie sévère associée à la région spécifique de la lamine A : le syndrome d’Hutchinson-Gilford ou progéria
I.3.4 Les syndromes progéroides récessifs associés aux lamines A et C
I.4. Les partenaires de l’enveloppe nucléaire associés à la chromatine
I.4.1 BAF
I.4.1.1. Les protéines à domaine LEM de la membrane nucléaire interne.
I.4.1.2. Les lamines.
I.4.1.3. Histones et protéines de remodelage de la chromatine
I.4.2 RBBP4
I.5. Hypothèses et objectifs
II. Résultats
II.1. Analyse structurale de la région nucléoplasmique de l’émerine
II.1.1 Purification de la région nucléoplasmique de l’émerine
II.1.2 Analyse structurale de la région nucléoplasmique de l’émerine monomérique
II.1.3 Etude de l’auto-assemblage de l’émerine
II.1.3.1. Structure
II.1.3.2. Fonction
II.2. Détermination d’un facteur de forme des fibres au cours du temps Etude de filaments protéiques grâce au système SF-WA-
II.2.1 Adaptation du modèle émerine à ce type d’expérience
II.2.2 Développement du système SF-WA-MALS-SAXS à l’aide du Fibrinogène
II.2.2.1. Automatisation du système de SF-WA-MALS-SAXS
II.2.2.2. Insertion d’une bulle d’air
II.2.2.3. Etude de polymérisation du fibrinogène
II.3. Etude de la région C-terminale intrinsèquement désordonnée de la lamine A
II.3.1 Production des échantillons nécessaires à l’étude structurale des régions désordonnées de la prélamine A et de la pro
II.3.1.1. Production des régions C-terminales de la prélamine A et de la progérine
II.3.1.2. Production des partenaires
II.3.1.2.1 BAF
II.3.1.2.2 SUN1
II.3.1.2.3 RBBP4
II.3.2 Etude par RMN des régions C-terminales désordonnées de la prélamine A et de la progérine
II.3.2.1. Les deux peptides possèdent une région conservée adoptant transitoirement une conformation en hélice 
II.3.2.2. Le peptide C-terminal de la lamine A reste difficile à obtenir sous une forme structuralement homogène
II.3.3 Etude de la farnésylation de la prélamine A et de son mutant progérine
II.3.4 Interactions médiées par les régions désordonnées de la prélamine A et de la progérine
II.3.4.1. Rôle de la région C-terminale désordonnée de la lamine A dans la régulation de l’interaction BAF-Lamine A
II.3.4.2. Interaction entre la région C-terminale désordonnée de la lamine A et SUN1
II.3.4.3. Etude de l’interaction entre la région C-terminale désordonnée de la lamine A avec RBBP4
III. Discussion
IV. Matériel et méthode
IV.1. Production des échantillons protéiques
IV.1.1 Tampons utilisés
IV.1.2 Production des protéines à partir des corps d’inclusion
IV.1.3 Production des échantillons solubles
IV.2. Microscopie électronique
IV.3. Cinétiques de fluorescence à la thioflavine T
IV.4. RMN en phase liquide
IV.5. RMN du solide
IV.6. Farnésylation in vitro
IV.7. Microcalorimétrie
V. Références
VI. Annexes
Publications
Attribution de l’émerine 67-170 (0M urée)
Attribution de l’émerine 67-170 (8M urée)
Attribution du peptide ProgCCtoA
Attribution du peptide ProgC
Attribution du peptide PreLamCCtoA
Détermination d’un facteur de forme des fibres au cours du temps
Utilisation d’un système de mélange rapide
Analyse des données de WA-MALS
Modélisation des données

Télécharger le rapport complet