Propriétés physicochimiques de l’haptoglobine

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Structure de l’Haptoglobine

Structure du gène de l’Hp

L’haptoglobine présente des différences structurales qui sont détectées en 1946 par Judas et Jayle . Cette protéine a trois phénotypes majeurs (Hp1-1, Hp2-2, Hp2-1). (87;106)
Les deux chaines polypeptidiques sont codées par des gènes localisés au niveau du chromosome 16q22 (41;20). Ces phénotypes sont contrôlés par deux allèles á savoir l’Hp1 et Hp2. L’allèle Hp1 est très conservé suivant les espèces alors que l’Hp2 n’est retrouvé que chez l’homme.(12)
L’allèle Hp1comporte 5 exons tandis que l’allèle Hp2 en comporte 7. Les 5ème et 7ème exons de ces 2 allèles codent pour la chaine β de l’haptoglobine.(122)
L’allèle Hp2 est le produit de duplication interne d’un fragment de ADN du gêne de l’Hp1 d’une longueur de 1700kb incluant les exons 3 et 4 ce qui fait que l’Hp2 comporte 7 exons (51), il n’a été retrouvé que dans l’espèce humaine (122). Il produit une chaine α plus longue.
Un autre génotype, Hp Johnson, a été décrit par Smithies en 1962. Il est de fréquence rare et diffère du gêne Hp1 au niveau de la sous-unité α par l’existence d’une triplication interne, toujours sur le même fragment de l’ADN du gène de l’Hp1.
De ce fait, l’allèle l’Hp Johnson contient 9 exons au lieu de 5. Ainsi, la chaîne α résultant de l’expression de l’allèle Hp Johnson, dénommée α3, a une masse molaire 3 fois plus importante que celle de la chaîne α1.(41)
Ainsi donc la combinaison de ces différents allèles aboutit à 6 génotypes et leurs phénotypes correspondant : Hp1S, Hp1F, Hp2FF, Hp2FS, Hp2SF and Hp2SS.
Les allèles Hp1S et Hp1F codent respectivement une chaine αS ou αF. Ces produits diffèrent au niveau des positions 52 et 53 sur deux acides aminés, avec pour la chaine αS l’asparagine et l’acide glutamique et pour la chaine αF la lysine et la lysine et l’acide aspartique.(122)

Structure de la protéine

L’haptoglobine est une protéine tétramérique avec une forte analogie structurale avec les immunoglobulines parce qu’elle comporte deux chaines légères α (α1 et α2) et deux chaines lourdes β liées entre elles par des ponts disulfures et aussi avec les serines protéases.
La chaine β de masse moléculaire de 40kda (245 aminoacides) n’est pas polymorphique. Cette chaine est identique pour tous les phénotypes majeurs de l’Hp. C’est une chaine polypeptidique comportant deux ponts disulfures inter chaines en position 148-179 et 190-219, et une liaison disulfure inter chaine α-β en position 105. Cette chaine β est porteuse des groupements glucidiques de l’Hp (120; 41). Le polymorphisme de l’Hp concerne la chaine α qui comporte trois phénotypes majeurs α1S, α1F et α2.
Les chaines α1 comportent 83 aminoacides. Ce sont des polypeptides comportant un pont disulfure intra chaîne reliant les positions 34-68 (41) et des ponts inter chaînes en position 15et 72 (α72β 105).
La chaine α1 présente deux sous-types suivant leur mobilité électrophorétique : α1S, α1F.
Ces deux sous-types différent uniquement par un acide aminé : la lysine en position 54 de la chaine est remplacée par l’acide glutamique sur α1S par le biais d’une mutation au niveau du gêne Hp1 (122;107).
La chaine α2 est un polypeptide de 142 acides aminés avec deux ponts disulfures reliant les positions 34-68 et les positions 93-127 et une liaison disulfure inter chaîne α-β en position 131 (α131-β105). Elles comportent en plus deux résidus cystéinyls en position 15 et 74 pouvant former des ponts disulfures entre les chaînes α. La présence de ponts disulfures a pour conséquence la formation de polymères de hauts poids moléculaires, linéaires pour le phénotype Hp1-1 et circulaires pour le phénotype Hp2-2. (41)
Parmi les trois phénotypes majeurs de l’haptoglobine, les phénotypes Hp1-1 et Hp2-2 sont homozygotes et le phénotype 2-1 est hétérozygote. Hp1-1 est constitué d’un tétramère (α1β) 2, alors que Hp2-2 est constitué de polymères cycliques (α2β)n. L’Hp2-1 est constitué d’un tétramère (α1β) 2 et de polymères linéaires constitués de chaînes α1, α2 et β.

Synthèse et Régulation de l’haptoglobine

L’haptoglobine est une protéine synthétisée par les hépatocytes mais aussi par les poumons, la peau, les cellules réticulo-endothéliales, les ganglions lymphatiques, le thymus, le rein et le tissu adipeux de la rate de souris. La synthèse de l’Hp est majorée suite à une stimulation produite par une augmentation de l’hormone de croissance, l’insuline, l’endotoxine bactérienne, les prostaglandines (13). La synthèse au niveau du foie est induite par les cytokines tels que les IL-6, IL-1 et le TNF (91). Trois régions de régulations de l’action de l’IL-6 ont été identifiées au niveau du promoteur du gène de l’Hp humaine : A (-157), B -111) et C (-61) (84;13). Au cours de la phase aiguë de l’inflammation, l’IL-6 induit un facteur nucléaire de transcription, l’interleukin-6-dependent binding protein (IL-6DBP), encore appelé complexe 4, qui remplace les protéines liées aux régions A et C (84). Il en résulte une activation de la transcription, donc de la synthèse de l’Hp. La région B fixe plusieurs protéines nucléaires différentes de IL-6DBP et qui forment des complexes identiques dans les cellules activées ou non par l’IL-6.(84;56)
En absence d’IL-6, le promoteur du gène de l’Hp est transcrit à un niveau basal.
Le comportement du complexe V est corrélé à l’activité transcriptionnelle ; la présence des protéines liées aux régions A et C (qui sont soit des répresseurs, soit de faibles activateurs), fait que le gène de l’Hp n’est que faiblement transcrit. En présence d’IL-6, la substitution des protéines des régions A et C par le complexe 4 induits par l’IL-6 entraîne une activation de la transcription, donc de la synthèse de l’haptoglobine.
La synthèse de l’Hp suit les mécanismes traditionnels de la biosynthèse des protéines : transcription de l’ADN en ARNm, maturation et épissage de ce dernier, puis traduction au niveau ribosomal en polypeptide précurseur lui-même maturé en peptide actif après glycosylation par les enzymes cellulaires, et enfin sécrétion. 30 % à 50 % de l’Hp circulante sont synthétisées chaque jour (88). Le dimère α/β est synthétisé sous forme d’un précurseur unique : la pro-pro-haptoglobine issue de la traduction d’un même ARN messager (124;115).La pro-pro-haptoglobine est constituée d’un peptide signal hydrophobe de 18 acides aminés contigus au segment N-terminal, d’une chaîne α formée de 83 acides aminés, d’un résidu arginine en position 84 et d’une chaîne β formée de 245 acides aminés et située du côté carboxy-terminal. La chaîne β de l’haptoglobine humaine possède 4 sites potentiels de N-glycosylation, alors que celle de la souris ou du rat en possède 2 (12;112). Au cours des étapes de maturation, le peptide signal est enlevé et la pro-pro- Hp se dimèrise pour former une pro-Hp. Le radical de la sous-unité β glycosylée est transformé en complexe de chaînes de liaisons de l’acide sialique au niveau de l’appareil de golgi, entraînant la formation de pro-haptoglobine glycosylée. La pro-haptoglobine est clivée au niveau du résidu arginine en position 84 pour donner un résidu de chaîne α de 84 acides aminés et un autre de chaîne β de 245 acides aminés (124;43). Les 2 chaînes α et β sont reliées entre elles par des ponts disulfures et l’arginine en position 84 des chaînes α est enlevée par une carboxypeptidase circulante (64). La protéine d’Hp mature consiste en une glycoprotéine avec environ 20 % de résidus glucidiques. (112)
Les concentrations en Hp circulante varient durant la vie. Chez le nouveau -né, elles sont plus faibles (0,2 g/L) (11), mais augmentent rapidement au cours des premiers jours de la vie. Elles atteignent les concentrations retrouvées chez l’adulte au bout de 8 à 10 mois (54) . Chez les adultes sains, les concentrations d’Hp sont comprises entre 0,4 et 2,27 g/L (98;57). Ces concentrations sont dépendantes du phénotype d’Hp. Les individus ayant le phénotype Hp1-1 ont des concentrations d’Hp plus élevées que ceux de phénotype Hp2-2, les concentrations des individus avec le phénotype Hp2-1 étant intermédiaires. Les concentrations d’haptoglobine circulante sont modulées par l’action combinée d’hormones activatrices et inhibitrices de sa synthèse.

Propriétés physicochimiques de l’haptoglobine

L’Hp est une α2 glycoprotéine qui comporte 19% de glucides et a une demi-vie de 3 à 5 jours. Son pH de 4,2 est dû à une richesse en acides aminés acides comme l’acide aspartique et l’acide gluconique et à une richesse en lysine. (8)

Propriétés électrophorétiques

L’Hp a été mise en évidence pour la première fois par Smithies en 1955 à l’aide d’une électrophorèse sur gel d’amidon. Ces techniques basées sur la formation d’un complexe stable Hb-Hp à activité péroxidasique, permet de distinguer les trois phénotypes majeurs de l’Hp en fonction du degré de polymérisation de chaque phénotype :
Hp 1-1 : avec une seule bande qui migre assez loin vers l’anode mais un peu moins vite que l’Hb résiduelle.
Hp 2-1 : bandes rapides mais moins fortement colorées, plus lentes .Nous observons plusieurs bandes qui semblent s’évanouir à mesure qu’on s’approche de l’origine.
Hp 2-2 : ne possède pas de bandes rapides. On note la présence de bandes lentes mais d’aspect différent de ceux du type Hp2-1.(78) La mobilité électrophorétique de l’Hp est de 4,5 unités Tiselius dans un tampon pH 8,6. Son point isoélectrique (pI) varie de 3,9 à 4,2 en fonction des phénotypes (126).L’électrophorèse en gel d’amidon dans un tampon formiate à pH 4,0 en présence d’un mélange de 2-mercaptoéthanol (5%) et d’urée (8 mol/L) qui rompt les ponts disulfures et sépare ainsi les polypeptides α et β, permet d’individualiser les différents sous-types de l’Hp.

Solubilité

L’Hp présente une précipitation dans une solution de sulfate d’ammonium à 2,0 mol/L. Les formes polymérisées telles que Hp2-2 précipitent dans une solution plus concentrée de l’ordre de 2,0 -2,4 mol/L. (88)

Masses molaires

Différentes études menées concernant la détermination des masses moléculaires des phénotypes d’Hp donnent des résultats qui varient légèrement en fonction des méthodes de mesure utilisées (53;57).Les masses moléculaires apparentes suivantes ont été proposées (12;57).

Fonctions de l’Haptoglobine

Fonctions antioxydante et anti-inflammatoire

En cas d’hypoxie, tel que ce qui se produit dans une blessure, une infection ou une tumeur maligne, des espèces d’oxygène avec électrons libres sont générées au cours du transport mitochondrial des électrons, les ROS. Ces derniers sont connus pour être hautement réactifs , leur production entraîne des dommages au niveau des membranes cellulaires et des macromolécules (lipides, protéines et ADN) (116). En outre les cellules du système immunitaire générant les ROS produisent également des espèces réactives de l’azote (RNS), par exemple, le peroxynitrite (ONOO) par l’interaction entre oxyde et superoxyde nitrique , qui sont tout aussi dommageables pour les membranes cellulaires et l’ADN. Les antioxydants non enzymatiques cellulaires dont la vitamine C, la vitamine E, le glutathion et d’autres, maintiennent l’homéostasie cellulaire redox afin de prévenir ou de contrôler les dommages cellulaires dans le cas d’une réponse inflammatoire. L’Hp possède une activité antioxydante de phénotype dépendant innée qui dépasse de loin celle de la vitamine C (acide ascorbique) (114) et contribue de manière significative à ce processus, notamment sur les sites extravasculaires. À la fois in vitro et in vivo . Des études in vivo ont établi que les sujets avec l’Hp1-1 sont plus susceptibles de résister au stress oxydatif cellulaire que ceux qui ont le phénotype Hp2-2, avec Hp2-1 étant intermédiaire (114) Comme antioxydant spécifique, les fonctions de la protéine au niveau des sites extravasculaires sont:
– l’activation des neutrophiles ;
– le maintien du transport inverse du cholestérol ;
– l’inhibition de la cyclo-oxygénase (COX) et lipoxygénases

L’activation des neutrophiles

Au cours de l’exercice, d’une blessure, un traumatisme ou une infection, les cellules cibles sécrètent les cytokines pro-inflammatoires primaires IL-1 et TNF-α, qui envoient des signaux aux cellules vasculaires adjacentes pour initier l’activation des cellules endothéliales et le recrutement des neutrophiles. Les neutrophiles activés, qui sont d’abord dans la ligne de défense, vont aider dans le recrutement d’autres cellules inflammatoires par extravasation (55). Les neutrophiles se mettent à générer des ROS ainsi que le recrutement d’autres cellules de défense, en particulier les monocytes et les macrophages. L’Hp est synthétisée lors de la différenciation granulocytaire et stockée pour la libération de neutrophiles activés (110). L’activation des neutrophiles peu survenir en l’absence de blessure (pendant l’exercice) (90).Dans une étude récente sur l’ischémie – reperfusion et la taille de l’infarctus du myocarde chez la souris, il a été montré que l’allèle Hp2 est associé à un niveau plus élevé à la peroxydation des lipides produits mais également stimule l’expression de la cytokine IL-10 antioxydant (10). Le phénotype Hp2-2 a toujours été observé pour être un facteur de risque dans les maladies inflammatoires (22;63;85) et cela est attribué à son rôle antioxydant compromis par rapport à l’allèle Hp2.

Le maintien du transport inverse du cholestérol

Des niveaux élevés de LDL constituent un risque majeur pour l’athérosclérose. Les LDL cholestérol oxydées s’infiltrent facilement dans l’intima artérielle, où ils sont endocytosés par les macrophages conduisant finalement à la formation de cellules spumeuses et de stries lipidiques (46). D’autre part, les HDL jouent un rôle clé dans le sens inverse du transport du cholestérol, de même que la lécithine cholestérol acyl transférase (LCAT).
Les HDL-cholestérol sous la forme d’Apo A-1 stimulent la LCAT et sert d’accepteur du cholestérol estérifiée. De cette façon, Apo A-1 soutient le transport du cholestérol pour la dégradation dans le foie, ce qui empêche son accumulation dans les macrophages pour former des cellules spumeuses. Dans un rapport récent, il a été montré que Hp se lie à l’Apo A-1 pour le protéger contre les radicaux libres et empêcher également les HDL de former des adduits avec d’autres molécules de lipoprotéines (102). Ce qui a un avantage important pour la santé dans les maladies cardiovasculaires.

Inhibition de la COX et LOX

L’acide arachidonique est le substrat de la synthèse des leucotriènes et les prostaglandines (PGE) par les enzymes LOX et COX, respectivement. La COX est constituée de deux isoformes, la COX-1 qui est exprimée de manière constitutive et COX2 qui est induite par stimuli. Les Prostaglandines et les leucotriènes participent à l’immunomodulation, la régulation positive des gènes apoptotiques, la croissance et réparation des tissus . La LOX est également connu pour participer à l’oxydation des LDL, ce qui peut conduire à la production de peroxydes lipidiques. Il a été démontré que l’Hp inhibe à la fois la COX et LOX qui fournit un moyen de moduler les réponses à une inflammation ou une infection qui peut être nocif pour les tissus. (101)

Autres activités antioxydantes

En tant que chaperon moléculaire, Hp inhibe l’auto-association inappropriée des protéines induites par oxydation ou par la chaleur. Cette fonction met l’Hp aux côtés de la clustérine comme majeure protéine extracellulaire qui protègent contre les mauvais repliement des protéines, en aidant au maintien de la fonction cellulaire (127). L’Hp présente est une élévation persistante au cours de la grossesse, l’infarctus du myocarde et de l’obésité (9;10;16).
L’Hp joue le rôle à la fois de ligand pour Mac-1 (complément récepteur de type 3, CD11b / CD18) et un facteur requis pour la cellule lors de la migration (50) et de l’angiogénèse (17). La réparation tissulaire et la régénération sont réalisés grâce au collagène et au mouvement des fibroblastes au sein la matrice extracellulaire. L’Hp inhibe les activités de la métalloprotéinases matricielles (MMP-2, MMP-9) nécessaires à la répartition de la gélatine et directement favorise la migration des fibroblastes nécessaires pour la régénération tissulaire de Kleijn (50). Sur les sites extravasculaires, l’Hp est responsable d’activités anti-inflammatoires qui sont importants pour le maintien de l’homéostasie redox .(50)

Complexe Hp-Hb

L’Hb assure l’oxygénation des cellules avec de l’oxygène pour les besoins énergétiques. Cependant, en dehors de la membrane des érythrocytes (Hématies), Hb est très toxique (2). Il est constitué d’un groupe prosthétique, hème, qui est lipophile. Il s’intercale facilement dans les membranes cellulaires perturbant ainsi les bicouches lipidiques. Le Fer (Fe2+) présent dans l’hème catalyse la génération de ROS par les réactions de Fenton et Haber-Weiss (99). En outre, l’Hb se lie avec avidité à l’oxyde nitrique, appauvrissant la cellule d’un modulateur du tonus vasculaire majeur et entraînant des changements vasomoteurs (77). La présence de l’Hb libre est donc une alerte qui est très rapidement atténuée par des mécanismes qui permettent son évacuation rapide et efficace de la circulation ou du site de la lésion.
L’Hp se lie à Hb pour prévenir les dommages oxydatifs de l’ Hb et aussi limiter la libération de l’hème, qui exacerbe l’oxydation stress. L’Hb peut donc agir comme un modulateur secondaire du rôle anti-inflammatoire de l’Hp. En général, l’élimination de l’Hb de la circulation suite à une hémolyse intravasculaire ou extravasculaire est accomplie par trois mécanismes principaux:
 la liaison à haute affinité de Hb-Hp
 la liaison de l’hème à hémopéxine (HPX) une affinité élevée
 la liaison à faible affinité de Hb à CD163.
Les mécanismes impliquant HPX et CD163 semblent fonctionner pendant ou hémolyse localisée, où la concentration d’Hp est débordée ou limitée, et cet examen se concentrera sur les interactions Hp-Hb. L’expression du récepteur CD163 est augmentée par les glucocorticoïdes, l’interleukine-6 et l’interleukine-10 (39;41). Les deux protéines , Hp et Hb, sont constituées de dimères mais l’interaction pour former le complexe Hp-Hb se produit principalement par la chaîne α de Hb et la chaîne β de Hp (31). La chaîne β de l’hémoglobine humaine contient deux sites spécifiques de fixation de l’Hp situés au niveau des résidus β11-25 et β131-146, alors que la chaîne α en possède un seul situé au niveau des résidus α 121-127 (74;41). Des quantités équimolaires d’Hp se lient à Hb (76). Chaque dimère αβ de l’Hp fixe un dimère αβ de l’Hb (127;41) ; bien que l’Hp est normalement présent dans le sérum en excès supérieure 400 molaire par rapport à Hb libre (12). Après la formation d’un complexe Hp-Hb, le récepteur scavenger CD163 exprimé sur la surface des monocytes et des macrophages tissulaires permet une endocytose du complexe, qui est suivie par la dégradation dans le foie et la rate (52). Des auteurs ont rapporté que la taille du complexe Hb-Hp retarde sa filtration au niveau du glomérule, ce qui permet de l’éliminer par le système réticulo-histiocytaire (100). L’élimination du complexe permet de préserver le rein contre les dommages oxydants pouvant résulter de la présence de l’Hb extracellulaire.(76)
L’haptoglobine circulante est saturée quand la concentration d’Hb plasmatique est de 0.5 à1.5 g/L (118). La demi-vie de l’Hp est environ de 3,5 jours, alors que celle du complexe Hp-Hb est approximativement de 10 minutes (13). La clairance du complexe Hp-Hb de l’organisme est importante. La capacité de liaison Hb et l’affinité du complexe Hp-Hb pour CD163 sont phénotypes dépendants (52). La HBC mesure la capacité d’un phénotype Hp à protéger contre un épisode hémolytique (dommages cellulaires Hb liés et la libération de l’hème). Cette activité, qui est classé dans l’ordre Hp1-1> Hp2-1> Hp2-2 (42), explique en partie la capacité des phénotypes pour prévenir le stress oxydatif lié à l’Hb. (101)

Table des matières

Introduction
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
I. Généralités sur les Accidents Vasculaires Cérébraux
1. Définition des AVC
2. Classification des AVC
3. Epidémiologie
4. Etiologies
5. Facteurs de risque
6. Physiopathologie
7. Symptomatologie
8. Les marqueurs biologiques des AVC
a. Les microparticules cellulaires : un nouveau type de biomarqueur
b. Les leucocytes derived microparticules(LMP)
9. La Prise en charge Thérapeutique
a) Mesures générales
b) Traitement
Traitement antihypertenseur
II. Généralités sur l’Haptoglobine
1. Définition et historique
2. Structure de l’Haptoglobine
a. Structure du gène de l’Hp
b. Structure de la protéine
3. Synthèse et Régulation de l’haptoglobine
4. Propriétés physicochimiques de l’haptoglobine
a) Propriétés électrophorétiques
b) Solubilité
c) Masses molaires
5. Fonctions de l’Haptoglobine
A. Fonctions antioxydante et anti-inflammatoire
B. Complexe Hp-Hb
C. Immunomodulation
D. Inflammation et Hp
E. Haptoglobine et Angiogénèse
6. Haptoglobine et Maladies Cardiovasculaires
TRAVAIL EXPERIMENTAL
I. Méthodologie
1) Type d’étude
2) Cadre d’étude
3) Population d’étude
a. Patients
b. Témoins
4) Prélèvement
5) Paramètres étudiés
a. Données épidémiologiques :
b. Données Biologiques :
6) Méthodes
a. Polymorphisme du gène de l’haptoglobine
b. Bilan lipidique
7) Exploitation statistique
II. Résultats
1. Caractères épidémiologiques de la population
4. Evaluation de la distribution des génotypes d’Hp
5. Etude des paramètres du bilan lipidique
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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