PROPRIÉTÉS ANTIOXYDANTES DE LA NORBADIONE A ET DES ACIDES PULVINIQUES

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Les acides pulviniques

La biosynthèse d’un acide pulvinique,3 l’acide atromentique, est brièvement présentée dans le Schéma 2. L’acide p-hydroxyphénylpyruvique 9 est obtenu via le chorismate 7 et le préphénate 8 qui sont des intermédiaires dans la biosynthèse de nombreux composés naturels.8 Une double condensation de l’acide 9 conduit par réaction enzymatique à une terphénylquinone 10. Celle-ci est ensuite oxydée en acide atromentique en passant par un intermédiaire hypothétique11.

Propriétés physico-chimiques

Détermination des constantes de protonation de la norbadione A

La norbadione A possède sept sites de protonation : deux énols, deux acides carboxyliques et trois phénols. L’équipe d’Albrecht-Gary a déterminé les valeurs de constantes de protonation de la norbadione A en combinant la potentiométrie, la spectrométrie d’absorption UV-visible et la RMN 1H. L’attribution des constantes de protonation est indiquée dans la Figure 7.

Dans une étude récente, faisant appel à des techniques similaires, l’équipe de Spiess a émis l’hypothèse que les pka les plus faibles correspondaient aux fonctions acides carboxyliques.10 Cependant, cette hypothèse a été infirmée par la meê équipe, sur la base d’une étude de modélisation moléculaire.

Propriétés de complexation de césium

Les champignons possèdent une forte capacité d’extraction pour puiser leurs nutriments dans le sol. L’absorption s’effectue grâce à des récepteurs spécifiques situés sur les membranes du mycélium. Capables d’extraire des éléments, stablesou radioactifs, présents dans le sol, les champignons ont également la particularité de les ccumulera grâce à un métabolisme assez lent.

Garaudée, S.; Elhabiri, M.; Kalny, D.; Robiolle, C;. Trendel, J.-M.; Hueber, R.; Van Dorsselaer, A.; Albrecht, P.; Albrecht-Gary, A.-M. Chem. Commun. 2002, 944-945.

Après l’accident de Tchernobyl en 1986, plusieurs espèces de champignons, dont le bolet bai, présentaient un taux anormalement élevé en césium37,1 un des principaux radioéléments émis dans l’atmosphère lors de l’accident. L’équipe de Steglich a alors examiné si la présence de pigments tels que le norbadione A et la badione A pouvait jouer un rôle dans l’accumulation du césium.13 Des expériences lui ont permis de montrer que la norbadione A forme un complexe 1:1 avec le chlorure de césium et que des dérivés pulviniques plus simples, tels que l’acide atromentique et l’acide x érocomique, sont de moins bons complexants pour le césium. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que la norbadione A possède deux chaînes pulviniques, offrant un arrangement spatial plus favorable à la complexation.

Plus récemment, l’équipe d’Albrecht-Gary a réalisé une étude de complexation de la norbadione A en combinant la spectrophotométrie d’absorption en UV-visible et la spectrométrie de masse (SM-ESI). La complexation de la norbadione A a été réalisée en milieu méthanol/eau tamponnée à pH = 6,1 (pH physiologique des champignons). A ce pH, la norbadione A est sous une forme diénolate, notée LH(Schéma 3). Deux types de complexes ont été observés lors de l’étude, un premier complex norbadione/césium de stœchiométrie 1:1 (LH5)Cs et un second de stœchiométrie 1:2 (LH 5)Cs2.

Propriétés antioxydantes de la norbadione A et desacides pulviniques

Généralités sur les antioxydants

Par définition, un antioxydant est une substance capable de neutraliser les espèces réactives de l’oxygène ou de réduire les dommages causés par cesespèces dans l’organisme. Les espèces réactives de l’oxygène, qui peuvent être des radicaux libres ou des espèces neutres, sont produites à partir de l’oxygène par divers mécanismes physiologiques et sont utiles au fonctionnement de la cellule. Parmi ces espèces, on peut citer le radical hydroxyle et l’anion superoxyde.

Dans les conditions normales, des radicaux libres sont produits en permanence en faibles quantités et leur concentration est parfaitement maîtrisée. Dans un organisme sain, la balance antioxydants/pro-oxydants est en équilibre. Si tel n’est pas le cas, que ce soit par déficit en antioxydants ou par suite d’une surproduction de radicaux, l’excès de ces radicaux est appelé

stress oxydant ». Cette rupture d’équilibre, lourde de conséquence, peut avoir de multiples origines : défaillance nutritionnelle, anomalies génétiques, exposition à des radiations, intoxication par des métaux lourds…)

La production excessive de radicaux libres peut provoquer des lésions directes de molécules biologiques (oxydation de l’ADN, des protéines, des lipides, des glucides) mais aussi des lésions secondaires dues au caractère cytotoxique et mutagène des métabolites produits, notamment lors de l’oxydation des lipides.

Le stress oxydant est impliqué dans de très nombreuses maladies. La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l’âge, car le vieillissement diminue les défenses antioxydantes et augmente la production mitochondriale de radicaux. Le stress oxydant serait à l’origine de plusieurs maladies, d ont les plus importantes sont les cancers, les maladies cardiovasculaires ou les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer.

Les antioxydants sont susceptibles d’être utilisés pour contrecarrer les effets des rayonnements ionisants sur les organismes. En effet, ces rayonnements produisent eux-mêmes des radicaux libres, notamment par interaction avec l’eau dans les cellules.

Analogies structurelles de la norbadione A avec des antioxydants connus

Pour lutter contre le stress oxydant, les cellules ont développé des systèmes de défense. Ces systèmes de défense sont des enzymes comme la superoxyde dismutase, les catalases ou la glutathion peroxydase, mais également des moléculesantioxydantes endogènes, comme le glutathion.

De plus, l’alimentation peut fournir un grand nombre d’antioxydants. Les principaux sont la vitamine E, la vitamine C, le-carotène, les oligo-éléments (sélénium, cuivre, nc,zi manganèse), les polyphénols et les flavonoïdes.

Il est intéressant d’observer que la norbadione A et les acides pulviniques tel que l’acide variégatique comportent des analogies structurellesavec des antioxydants connus (Figure 10). En effet, ils possèdent un motif acide tétronique, comme l’acide ascorbique, et des fonctions phénols, comme la vitamine E, le resvératrol ou les flavonoïdes.

Mise en évidence des propriétés antioxydantes

L’activité antioxydante peut être mise en évidencepar différents tests. Au laboratoire, des tests de protection de la thymidine et de plasmides ont été réalisés. Dans ce paragraphe, seuls les principaux résultats obtenus sont développés.

Test de protection de la thymidine

Un test in vitro adapté pour le criblage à haut débit a permis d’évaluer l’activité antioxydante de nombreux composés, dont la norbadione A et certains acides pulviniques.16 Ce test a été mis au point au CEA de Saclay par F. Taran (SCBM, Service de Chimie Bioorganique et de Marquage) en collaboration avec les équipes de C. Créminon et D. Boquet (SPI, Service de Pharmacologie et d’Immunoanalyse) et de S. Pin et J.-P. Renault (SCM, Service de Chimie Moléculaire).

Principe du test

Ce test s’appuie sur l’étude de la dégradation d’une cible biologique, la thymidine, nucléoside de l’ADN, sous l’action de trois types de stress ox ydants : l’irradiation (source 137Cs), l’irradiation UV à 254 nm en présence de peroxyde d’hydrogène et un système métallique de type Fenton (Fe2+/H2O2) (Figure 11).
Le test est réalisé dans des plaques 96 puits et permet l’évaluation simultanée de nombreux produits. Dans chaque puit, la thymidine en présence d’un composé potentiellement antioxydant est soumise à un stress oxydant. La thy midine intacte est ensuite quantifiée par un dosage immunoenzymatique, qui utilise un anticorps spécifique de la thymidine (Figure 12). Les résultats sont exprimés en pourcentage de protection de la thymidine.

Test sur plasmide

Ce test consiste à soumettre un plasmide (ADN doubl e brin circulaire, non chromosomique, extrait d’une bactérie) à un stress oxydant en présence d’un agent potentiellement antioxydant. Le plasmide superenroulé, sous l’effet d’un stress, conduit à un ADN circulaire provenant d’une rupture simple brin et à un ADN lin éaire provenant d’une rupture double brin. Les différentes formes d’ADN sont ensuite séparées par électrophorèse sur gel d’agarose. Ces tests ont été réalisés par les Dr SMeunier,. M. Hanédanian et B. Heurtaux.

Irradiation

Sous irradiation, le test met en évidence une protection dose-dépendante du plasmide (plasmide pUC18 irradié à 2,5 Gy min -1 pendant 30 min) par différents agents antioxydants dont la norbadione A. 19
Plusieurs dérivés d’acides pulviniques ont été évalués de cette manière. A la concentration maximale testée (500M), la protection du plasmide n’est pas totale. Cependant, les composés synthétisés protègent l’ADN de manière plus efficace que des antioxydants bien connus, comme l’acide ascorbique, le mannitol ou la curcumine.

Conditions de Fenton

Le test de dégradation de plasmides a été égalementréalisé sous un stress de type Fenton. Les oxydations du plasmide superenroulé pUC18 ont étééaliséesr par traitement avec 200M FeIISO4/EDTA/H2O2 (1:1:100) pendant 30 min. Dans ces conditions, la norbadione A ne protège pas l’ADN et son caractère pro-oxydant a ét confirmé par ce test. Par contre, plusieurs dérivés d’acides pulviniques se sont avérés efficaces dans ce test et de surcroît ne présentent pas de caractère pro-oxydant.

Toxicité

Des études in vitro menées par F. Leteurtre (CEA, SBIGeM : Service de Biologie Intégrative et Génétique Moléculaire), réalisées sur des cellules V7920 ont mis en évidence que plusieurs dérivés pulviniques n’étaient pas toxiques, contrairement à la norbadione A. Une toxicité in vivo relativement importante de la norbadione A chez la souris (DL50 = 58 mg/kg) a été montrée lors d’une étude réalisée par le Dr Rima (Université Paul Sabatier, Toulouse). La toxicité de plusieurs dérivés pulviniques a été également évaluée. Aucune toxicité n’a été observée à la limite de leur solubilité (environ 20 mg/kg).

Voies de synthèse des acides tétroniques décritesansd la littérature

Le motif acide tétronique étant présent dans la structure de nombreux composés bioactifs, de nombreuses voies de synthèse décrivent son accès. La condensation de Dieckmann et la lactonisation de-cétoesters-oxygénés ou-halogénés sont les deux méthodes les plus couramment utilisées. Dans ce paragraphe, ces deux méthodes ainsi que quelques approches moins classiques seront développées.

Condensation de Dieckmann

La synthèse d’acides tétroniques par condensation de Dieckmann a été décrite pour la première fois par Lacey en 1954. L’ouverture du dicétène par l’ -hydroxyisobutyrate de méthyle en présence de triéthylamine conduit à l’acétoacétate correspondant19 (Schéma 8). Celui-ci est ensuite cyclisé en acide tétronique20 en présence d’éthylate de sodium avec un très bon rendement.
Cependant, Lacey précise que lorsque l’hydroxyester de départ est un alcool secondaire les rendements en acide tétronique sont moins bons (de l’ordre de 50 %). Ces rendements ont été améliorés ultérieurement par Ley qui a utilisé duluoruref de tétrabutylammonium en tant que base pour effectuer la condensation de Dieckmann.59 Les auteurs ont rapporté, entre autres, la synthèse de l’acide carlosique (Schéma 9). L’alkylation régiosélective du-cétothioester 21 conduit à 22, qui est transestérifié par le malate de diméthyle.L’intermédiaire 23 obtenu est ensuite cyclisé par condensation de Dieckmann et donne l’acide tétronique 24 avec un rendement de 74 %. Aucune épimérisation du centre téréogéniques n’est observée. Après hydrolyse de l’ester 24 en milieu acide, l’acide carlosique est obtenu.

Réaction avec différents esters

D’autres acides tétroniques ont ensuite été synthétisés en modifiant les esters de départ73 qui sont commerciaux, ou qui ont été préparés à partirdes acides correspondants (Schéma 26). Les réactions ont été réalisées soit au reflux duHFT (condition A) soit dans le DMF à température ambiante (condition B). Certaines réactions étant incomplètes après quelques heures, dans un souci d’homogénéité, elles ont toutes été traitées après 16 h.
Les acides tétroniques préparés à partir des acétates de méthyle substitués par un groupement phényle ou méthoxyphényle (Tableau 3, entrées 1 à) 4ont été obtenus avec des rendements très satisfaisants. La position du substituant méthoxy sur l’aromatique influe peu sur le rendement. Lorsque l’aromatique est substitué en position 4 par un groupement hydroxyle ou par un halogène (entrées 5 à 9), les rendements varient entre 60 et 98 %. En revanche, lorsque l’aromatique est substitué en para par un groupement fortement électro-attracteur tel que le groupement nitro, l’acide tétronique correspondant n’est pas obtenu (entrée 10). Dans ce cas, l’ester de départ est retrouvé intact en fin de réaction. Il semble que du fait de l’acidité des protons en position benzylique, un énolate stable se forme et empêche la réaction de transestérification d’avoir lieu. Un essai a été réalisé avec un ester comportant un hétérocycle en position 3. Dans ce cas, l’acide tétronique correspondant a été obtenu avec un rendement de 70 % (entrée 11).
Les différents acides tétroniques synthétisés sontfacilement identifiables en RMN 1H ; les protons méthyléniques ont des déplacements chimiques variant entre 4,73 et 4,83 ppm dans l’acétone-d6.

Synthèse d’acides tétramiques non substitués suratomel’ d’azote

Dans un premier temps, nous avons testé la faisabilité de la réaction avec le 4-méthoxyphénylacétate de méthyle73a et l’aminoester le plus simple, l’ester méthylique de la glycine 105a, qui est commercialisé sous forme de chlorhydrate (Schéma 37). Ce chlorhydrate a été employé directement dans les réactions ; ceci impliquait donc d’utiliser un équivalent de base supplémentaire afin de neutraliser l’acide.
Plusieurs essais, réalisés dans le THF à reflux avec des quantités variables de base, n’ont pas conduit à l’acide tétramique 104a attendu. Seule la formation de produits secondaires a été observée. En revanche, à partir de l’ester tert-butylique de la glycine 105b, l’acide tétramique attendu 104a a pu être isolé, lorsque 2,5 équivalents de basento été employés, mais avec un rendement faible de 20 %. Ce rendement est principalement dû à une faible conversion de l’ester de départ en acide tétramique. Cette conversion n’est en effet que de 38 %, d’après le spectre de RMN 1H. Celle-ci n’a pas pu être améliorée en augmentantle nombre d’équivalents de base et le temps de réaction.
La différence de réactivité entre les deux aminoesters et le faible rendement pourraient être dus à une polymérisation de l’aminoester dans les conditions de la réaction.
De ce fait, il a été envisagé d’utiliser des aminoesters comportant une fonction amine secondaire.

Synthèse d’acides tétramiquesN-méthylés

D’autres essais ont été réalisés avec le sarcosinate de méthyle105c, commercialisé également sous forme de chlorhydrate et le 4-méthoxyphénylacétate de méthyle73a, en présence detert-butylate de potassium dans le THF à reflux (Schéma 38).
Après 4 heures au reflux, l’acide tétramique104b a été obtenu avec un rendement de 38 % (Tableau 5, entrée 1). Le rendement est amélioré rsquelo le mélange réactionnel est maintenu au reflux pendant une nuit (entrée 2). En outre, un meilleur rendement est obtenu lorsque l’acide tétramique est purifié par précipitation (entrée 3). En effet, l’acide tétramique étant peu soluble dans la majorité des solvants, des pertes non négligables sont observées lorsque la purification est effectuée par chromatographie sur silice. L’utilisation du sarcosinate de tert-butyle 105d conduit également à l’acide tétramique attendu 104b avec un rendement satisfaisant de 73 % (entrée 4). Cependant les produits bruts contiennent encore de l’ester de départ. L’utilisation de 3,5 équivalents de base aulieu de 2,5 équivalents n’a pas permis d’augmenter la conversion et a conduit à la formati on de nombreux produits secondaires.

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Table des matières

INTRODUCTION GÉNÉRALE
CHAPITRE I : NORBADIONE A ET ACIDES PULVINIQUES : GÉNÉRALITÉS
I. NORBADIONE A
II. LES ACIDES PULVINIQUES
III. BIOSYNTHÈSE
III.1.Norbadione A
III.2.Les acides pulviniques
IV. PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES
IV.1. Détermination des constantes de protonation de la norbadione A
IV.2. Propriétés de complexation de césium
V. PROPRIÉTÉS ANTIOXYDANTES DE LA NORBADIONE A ET DES ACIDES PULVINIQUES
V.1. Généralités sur les antioxydants
V.2. Analogies structurelles de la norbadione A avec des antioxydants connus
V.3. Mise en évidence des propriétés antioxydantes
V.3.1 Test de protection de la thymidine
V.3.2 Test sur plasmide
V.3.3 Toxicité
VI. CONCLUSION
CHAPITRE II : LES ACIDES TÉTRONIQUES
I. LES ACIDES TÉTRONIQUES NATURELS ET LEURS PROPRIÉTÉS
I.1. Acides 3-acyltétroniques
I.2. Acides 3-alkyltétroniques
I.3. Acides 3-alkoxytétroniques
I.4. Acides tétroniques non-substitués en position 3
I.5. Acides 3-aryltétroniques
II. VOIES DE SYNTHÈSE DES ACIDES TÉTRONIQUES DÉCRITES DANS LA LITTÉRATURE
II.1. Condensation de Dieckmann
II.2. Lactonisation de β-cétoesters γ-oxygénés
II.3. Autres méthodologies de synthèse
III. NOUVELLE APPROCHE UTILISANT UNE RÉACTION TANDEM
III.1.Mise au point de la réaction
III.2.Réaction avec différents esters
III.3.Réaction avec différents hydroxyesters
III.4.Synthèse d’analogues d’acides tétroniques à 6 ou 7 chaînons
IV. SYNTHÈSE D’ACIDES TÉTRAMIQUES
IV.1. Synthèse d’acides tétramiques non substitués sur l’atome d’azote
IV.2. Synthèse d’acides tétramiques N-méthylés
IV.3. Synthèse d’acides tétramiques N-benzylés
IV.4. Synthèse d’un acide tétramique bicyclique
V. CONCLUSION
CHAPITRE III : ACIDES PULVINIQUES : ASPECTS SYNTHÉTIQUES
I. SYNTHÈSE D’ACIDES PULVINIQUES : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I.1. Synthèse d’acides pulviniques symétriques
I.1.1 Utilisation d’une dicétone comme intermédiaire
I.1.2 Oxydation de quinones
I.2. Synthèse d’acides pulviniques dissymétriques
I.2.1 Utilisation d’une dicétone comme intermédiaire
I.2.2 Condensation de Dieckmann
I.2.3 Synthèse à partir de dérivés de l’anhydride maléique
I.2.4 Couplage de Suzuki-Miyaura
II. NOUVELLE VOIE DE SYNTHÈSE DE PULVINATES DE MÉTHYLE
II.1. Rétrosynthèse
II.2. Pulvinates de méthyle cibles
II.3. Synthèse des cétoesters
II.4. Préparation des alcools
II.5. Réaction de déshydratation et isomérisation
III. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
CHAPITRE IV : SYNTHÈSE TOTALE DE LA NORBADIONE A
I. ANALYSE RÉTROSYNTHÉTIQUE INITIALE
II. SYNTHÈSE DE LA PARTIE NORD
III. ETUDE DU DOUBLE COUPLAGE
III.1.Synthèse d’un analogue de la norbadione A
III.2.Vers la synthèse de la norbadione A
IV. NOUVELLES VOIES DE SYNTHÈSES ENVISAGÉES
V. SYNTHÈSE TOTALE DE LA NORBADIONE A
V.1. Avancement de la synthèse selon la voie a
V.1.1 Mise au point des conditions d’ouverture et de fermeture de la lactone
V.1.2 Ouverture de la lactone fonctionnalisée
V.1.3 Accès à l’intermédiaire bis(tétronique)
V.1.4 Réaction d’alkylidénation sur un composé modèle
V.2. Synthèse selon la voie b
V.2.1 Couplage avec une partie sud comportant un groupement triflate
V.2.2 Couplage avec une partie sud iodée
VI. CONCLUSION
CONCLUSION GÉNÉRALE
PARTIE EXPÉRIMENTALE
BIBLIOGRAPHIE