Production et purification des protéines

Production et purification des protéines

Le fragment Fab4E11-H6 a été produit dans la souche HB2151 d’E. coli et purifié comme décrit (Bedouelle et al., soumis). Les domaines E3.X-H6 ont été produits à partir des plasmides correspondants dans la souche BL21(DE3). Les bactéries ont été cultivées dans du milieu SB avec ampicilline à 24°C jusqu’à A600nm = 1.5-2 puis l’expression du gène recombinant a été induite avec 0.5 mM d’IPTG. Les étapes suivantes ont été effectuées dans du tampon A à 4°C. Les cultures bactériennes ont été centrifugées, les culots bactériens resuspendus dans 1 mg.mL-1 de polymixine B, 5 mM imidazole (25 mL par litre de culture) sous agitation pendant 1 heure, puis la suspension bactérienne centrifugée à 15.000 g pendant 10 minutes. Le surnageant (extrait périplasmique) a été traité avec 1 µg.mL-1 de DNase I, filtré à travers des pores 0,22 µm et chargé sur colonne de résine NiNTA (0.6 mL de résine par litre de culture). Les protéines fixées ont été lavées avec de l’imidazole 5 mM (20 volumes de résine) puis éluées par un gradient discontinu de 20 mM, 40 mM, 100 mM et 1 M imidazole. Les fractions protéiques ont été analysées par gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes; la concentration d’acrylamide:bisacrylamide (29:1) était de 15%. Les fractions les plus pures (homogènes à plus de 95%) ont été rassemblées et dialysées contre le tampon A, et enfin congelées à -80°C.

Tests protéiques

La concentration des domaines E3.X-H6 purifiés a été mesurée par spectrométrie d’absorbance. Les coefficients d’extinction molaire à 280 nm (ε280nm), tous égaux à 10.220 M1.cm-1, ont été calculés comme décrits (Pace et al., 1995). Les spectres de fluorescence ont été enregistrés à 20°C à l’aide d’un spectrofluorimètre Perkin-Elmer LS-5B. Les largeurs de fente étaient de 2.5 nm pour la lumière d’excitation et de 5 nm pour l’émission. La longueur d’onde d’excitation était égale à 278 nm, et le spectre d’émission a été mesuré entre 320 nm et 370 nm. Le pas de longueur d’onde était de 0.5 nm et la durée d’acquisition du signal de 2 secondes pour chaque longueur d’onde. Le signal de fluorescence pour la fraction protéique (1 µM) a été obtenu en soustrayant le signal du tampon de celui de l’essai. La valeur de la longueur d’onde de fluorescence maximum (λmax) a été obtenue en ajustant l’équation suivante au spectre expérimental, avec les paramètres a, b, c et λ max comme paramètres flottants (Monsellier et Bedouelle, soumis): Y(λ) = a + b ( λ – λ max )2 + c ( λ – λ max )3 Le test d’Ellman a été réalisé comme décrit (Creighton, 1989). Chaque réaction (1 mL) contenait 0.1 M de tampon phosphate, pH 7.3, 6 M chlorure de guanidinium (GdmCl), 1 mM EDTA, 0.15 mM DTNB et > 3 µM de protéine. La L-cystéine a été utilisée pour établir une courbe d’étalonnage et la BSA, qui contient une cystéine libre, comme contrôle positif. La formation de thionitrobenzoate (NTB) à partir du DTNB a été mesurée par l’absorbance à 412 nm. La limite inférieure de sensibilité du spectrophotomètre utilisé (Perkin-Elmer lambda 2) étant de 0.005 unités d’A412 nm, la limite inférieure de détection était de 0.44 µM de cystéines libres.

ELISA indirect

Les puits d’une plaque de microtitration ont été tapissés par E3.DV1-H6, E3.JEV-H6, E3.WNV-H6 ou E3.YFV-H6 à 1 µg.mL-1. Les mesures ont été faites à 25°C dans du PBS contenant 1% de BSA. Les protéines immobilisées ont été incubées avec 0.4 nM Fab4E11 pendant 1 heure. Les molécules liées de Fab4E11 ont été incubées avec un anticorps spécifique du fragment Fab d’IgG de souris, conjugué à la biotine (Sigma); un conjugué entre la streptavidine et la phosphatase alcaline (Sigma) a ensuite permis de révéler les anticorps anti-Fab fixés. Les valeurs d’absorbance ont été mesurées à 405 nm, et les valeurs corrigées par soustraction de l’absorbance du bruit de fond.

Détermination des constantes d’équilibre par ELISA

Les constantes KD de dissociation à l’équilibre en solution entre le fragment Fab4E11-H6 et les domaines E3.X-H6 et leurs mutants ont été mesurées par un test ELISA de compétition (Friguet et al., 1985). Les mesures ont été faites à 25°C dans du PBS contenant 1% de BSA. Fab4E11-H6 à une concentration constante de 0.2 nM et les domaines E3.X-H6 à 12 concentrations différentes ont été incubés ensemble en solution pendant 20 heures pour atteindre l’équilibre. La concentration en Fab4E11-H6 libre a été ensuite mesurée suivant le même protocole d’ELISA indirect que précédemment, la plaque de microtitration ayant été cette fois tapissée avec E3.DV1-H6 à 0.3 µg.mL-1.

Table des matières

INTRODUCTION
La dengue: vue générale
Epidémiologie et symptomatologie
Mécanismes physiopathologiques des formes graves de la dengue
Lutte anti-dengue
Etat actuel des connaissances
Contexte du travail
Affinité de mAb4E11 pour les quatre sérotpypes des virus de la dengue
Exploration du domaine E3.DV1 par mutagenèse en alanine
Présentation du projet
MATERIELS ET METHODES
Souches, plasmides et tampons
Constructions génétiques
Production et purification des protéines
Tests protéiques
ELISA indirect
Détermination des constantes d’équilibre par ELISA
Analyse des structures
RESULTATS
Production des domaines E3.X
Intégrité des domaines E3.X parentaux
Intégrité des domaines E3.X mutants
Transposition de l’épitope du sérotype1 vers le sérotype 4 des virus de la dengue
Absence de reconnaissance entre Fab4E11 et d’autres flavivirus
Transposition de l’épitope du sérotype1 dans les domaines E3 d’autres flavivirus
DISCUSSION
Structure de l’épitope de mAb4E11
Complétude de l’épitope
Bases moléculaires de la reconnaissance croisée des quatre virus de la dengue
Contre-spécificité pour les autres flavivirus
Corrélation avec la neutralisation
Mécanisme de neutralisation et comparaison avec d’autres flavivirus
Conclusion
PERSPECTIVES
REFERENCES

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