Production et applications d’une enzyme d’origine animale : la PEPSINE 

Enzymologie

L’enzymologie est la science qui étudie les enzymes.

Définition de l’enzyme

Les enzymes sont des protéinesactives qui accélèrent les réactions biochimiques sans être consommées ou être altérées aucours du processus. Elles se trouvent partout dans la nature, dans notre corps, dans l’environnement et dans toutes les choses vivantes. Elles sont capables d’agir aussi bien à l’intérieur qu’à l’extérieur de l’organisme qui les a produites. Sans elles, la vie neserait pas possible. Elles accélèrent les réactions chimiques et biochimiques et ce processus s’appelle la catalyse.
On appelle substrats les substances sur lesquelles les enzymes agissent comme catalyseur et chaque enzyme s’adapte et agit seulement sur un ensemble spécifique de substrats.
Nous distinguons deux catégories d’enzymes dans les organismes vivants:
– Les enzymes constitutives : Elles ont un stock quiescent avec une concentration constante, entraînant ainsi une utilisation directe.
– Les enzymes inductives, retrouvées en faible quantité, leur concentration augmente quantitativement en présence du substrat

Structure des enzymes

De nombreux arguments plaident en faveurde la nature protéique de toutes les enzymes : les méthodes de préparations sontcelles des protéines,la dénaturation par la chaleur qui entraîne parallèlement ladisparition de l’activité enzymatique (la thermolabilité est une des caractéristiques des enzymes).
Les travaux récents d’analyse des sites actifs de certaines enzymes et de la détermination de la structure de la plus petite enzyme connue (la ribonucléase qui se présente comme un gros polypeptide de poids moléculaire 12700), ont établi avec certitude que la molécule protéique est le support de l’activité enzymatique.
Une enzyme est par conséquent comme toute protéine constituée d’acides α-aminés agencés selon une conformation bien déterminée.
Certaines enzymes sont constituées d’une seule chaîne peptidique : les enzymes secrétées telles que laribonucléase pancréatique.
D’autres, plus nombreuses, sont constituées de plusieurs chaînes ou sous unités identiques ou différentes. On parle de protomère ou monomère formant une oligomère.

Les cofacteurs enzymatiques

Les apoenzymes sont inactives en l’absence des coenzymes. Ces dernières sont des molécules qui apportent leur propre réactivité et qui peuvent être de nature métallique (ions minéraux) ou organique ; elles sont indispensables à la catalyse.
L’apoenzyme intervient dans la spécificité de la réaction.
Ex : Les transaminases (enzymes qui transportent un radical amine d’un acide aminé sur un acide cétonique) et les décarboxylases d’acides aminés (enzymes qui catalysent la décarboxylation des acides aminés) ont une même coenzyme, le phosphate de pyridoxal et un même substrat : un acide aminé inclut dans une chaîne peptidique. La différence de réaction est donc liée à l’existence de deuxapoenzymesdifférentes. [11]
Les molécules qui sont des ions métalliques (magnésium, fer, cuivre, zinc) jouent un rôle dans la fixation du substrat sur le site actif et sont appelées : cofacteurs.
Les molécules de nature organique sont nommées coenzymes et seront notées CoE. Un certain nombre de coenzymes sontde nature nucléotidique (base azotée, pentose et molécule d’acide phosphorique) et dérivent des vitamines fournies parl’alimentation.
La coenzyme peut être très fermement liée à l’apoenzyme : on ne peut l’en détacher que par des méthodes qui dénaturent cetteapoenzyme. Ce type de coenzyme liée intervient dans les réactionsde matière stoekiométrique.
Elle peut tout aussi se détacher trèsfacilement de l’enzyme, par simple dialyse ; ceci explique que la dialyse puisse inactiver une enzyme. Les coenzymes libres interviennent dans les réactions de manière catalytique.
Nous distinguons les coenzymes des réactions d’oxydoréduction et les coenzymes des réactions de transfert de groupements.

Coenzymes d’oxydoréduction

Ils permettent le transport de protons (H+) et d’électrons (e-) dont les mouvements sont toujours couplés au sein des cellules. L’importancede ces transferts est capitale car ils sont à la base des processus du métabolisme énergétique cellulaire.
– La Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) et la Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate (NADP)
Il s’agit de coenzymes de déshydrogénases qui effectuent des transferts d’hydrogène. Elles dérivent de la vitamine PP (nicotinamide).

Le site actif

La totalité de la protéine enzymatique n’intervient pas dans la réaction ; seule une infime partie entre en jeu : le site actif. Sur ce site, si plusieurs acides aminés interviennent, ils ne sont pas nécessairement voisins sur la chaîne polypeptidique. Ils sont proches dans l’espace du fait de la structure secondo-tertiaire de la molécule.
Le site actif de l’enzyme est la région fonctionnelle de la molécule qui « accueille » le substrat permettant ainsi sa transformation. Le site actif présente généralement, un site de positionnement et un site catalytique. Le premier permet de maintenir et d’orienter le substrat tandis que le second réalise la catalyse. [12]
Ex : Dans le cas de la RNAse pancréatique, la lysine41 assure le positionnement alors que les deux histidines permettent la catalyse.
La dénaturation éloigne les acides aminésnormalement voisins du site actif et ainsi, inactive l’enzyme.
L’observation des sites actifs par la cristallographie aux rayons X, la modélisation informatique de la forme des molécules ont permis d’établir un certainnombre de caractéristiques de ces régions fonctionnelles.

Un microenvironnement d’où l’eau est exclu

Le site actif occupe une part relativement réduite du volume total d’uneenzyme et il n’est pratiquement jamais situé en surface de l’enzyme. Il se trouve en profondeur et constitue une cavité, sorte de microenvironnement dont le caractère augmente les forces de liaison au substrat. De plus, l’eau est exclue grâce à un environnement généralement hydrophobe. Cette exclusion est une condition nécessaire à la catalyse enzymatique puisque l’eau est un solvant polaire.
En effet, la molécule d’eau se comporte comme un corps diélectrique c’est-àdire un corps qui diminue le champ électrique dans lequel il se trouve placé.
La présence de l’eau affaiblit les forces entre les atomes constitutifs des molécules d’enzymes et de substrat. En effet, si des molécules d’eau sont dans le milieu, elles peuvent contracter des liaisons H avec le substrat ou l’enzyme ou bien les deux. Il se produit une sorte de compétition entre l’eau et le substrat pour occuper le site actif. Il en résulte une fragilité du complexe enzyme-substrat et donc une perte de l’efficacité enzymatique.

Des forces d’interaction faibles

Les substrats sont liés aux enzymes par des forces relativement faibles.
L’enthalpie libre d’interaction est de 10 à 50kJ mole -1 c’est-à-dire 10 à 20 fois moins qu’une liaison covalente. Il s’agit le plussouvent de liaisons H dont le caractère directionnel permet un haut degré de spécificité entre l’enzyme et son substrat.

Un nombre limité de résidus impliqués dans la reconnaissance

Bien que les enzymes soient des macromolécules, seule une petite partie de la molécule interagit avec le substrat. Il est fréquent que lafixation et la catalyse reposent sur cinq ou six résidus.
Le lysozyme de l’œuf de poule, par exemple, est une protéine de 129 acides aminés, le site actif n’étant constitué que de 19 d’entre eux. Ainsi, seul 15% de résidu sont impliqués dans l’activité catalytiqueet notamment GLU-35 (Acide Glutamique en position 35) et Asp-52 (Acide Aspartique en position 52) qui sont directement impliqués dans la rupture dela liaison glycosidique du substrat. Ces deux résidus, séparés par 16 acides aminés dans la structure primaire, se trouvent proche par repliement de la protéine enune structure compact.

Propriétés générales des enzymes

Les enzymes possèdent des caractéristiques qui les rendent uniques au sein du monde vivant.

Enzymes, des Catalyseurs

Les enzymes partagent les caractéristiques générales des catalyseurs chimiques.
– Elles sont intactes à la fin de la réaction : elles n’apparaissentpas dans l’équation bilan de la réaction.
– Elles accélèrent les réactions biochimiques pour les rendre compatibles à la vie.
– Ces réactions biochimiques sont réversibles. Les enzymes accélèrent les deux sens de réaction dans les mêmes proportions ; elles permettent donc d’atteindre plus rapidement l’équilibre, maisne peuvent le déplacer.

Spécificité des enzymes

Nous distinguons deux types de spécificités : la spécificité de réaction et la spécificité de substrat.

Spécificité de réaction

Une enzyme ne peut déplacer l’équilibre d’une réaction ; mais, elle peut accélérer l’établissement de cet équilibre. Si plusieurs réactions sont possibles, une enzyme donnée ne peut catalyser qu’une parmi les différentes réactions possibles.
C’est ainsi qu’un acide aminé peut subir une désamination oxydative catalysée par une oxydase, une décarboxylation par une décarboxylase.

Spécificité du substrat

Les enzymes apparaissent comme adaptées à la dégradation d’une substance déterminée ou d’un petit nombre de substrat de constitution voisine. On a longtemps considéré la spécificité enzymatique commetrès étroite puis on s’est rendu compte qu’il existe des spécificités de groupe ou de fonction.
Dans la classification actuelle des enzymes, chaque type d’enzyme répond à une spécificité, soit vis-à-vis d’une réaction chimique, soit vis-à-vis d’un substrat particulier.
On distingue par exemple à côté d’enzymes comme l’arginase, l’uréase, qui n’agissent que sur un seul corps, des protéases qui hydrolysent diverses protéines, les peroxydases qui décomposent les peroxydes en présence d’un accepteur d’oxygène.
La comparaison de l’enzyme à une serrure faite par E. FISCHER doit alors être modifiée et les enzymes actives sur un type de liaison sont présentées plutôt comme « une passe-partout d’un garçon d’hôtel qui ouvre, non pas une mais toutes les portes de son étage de service et uniquement celles-ci. »
Dans ces différentes catégories d’enzymes, chacune est douée d’une spécificité propre qui comporte des degrés.

Influences des facteurs chimique : les effecteurs

Outre les différents facteurs physiques dontnous avons étudiél’influence, il existe les effecteurs qui sont des composés chimiques qui modifient les réactions enzymatiques. On distingue les activateurs et les inhibiteurs ; mais aussi, certains effecteurs comme les ions métalliques qui peuvent se comporter en activateur ou inhibiteur selon les conditions des réactions.
Les effecteurs présentent un double intérêt : un intérêt physiologique d’une part, car certaines jouent un rôle biologique importante en particulier dans la régulation des métabolismes et, un intérêt biochimique d’autre part, car elles permettent d’acquérir des notions importantes sur le mode d’action des enzymes. [11]
Tous les effecteurs chimiques agissent en se combinant soit à l’enzyme, soit avec le complexe enzyme-substrat, soit au substrat lui-même. Les combinaisons sont plus ou moins stables et peuvent être réversibles ou irréversibles.

Les inhibiteurs

Il existe différentes modalités d’inhibition : inhibitionsréversibles etinhibitions irréversibles. L’effet net inhibiteur correspond à une diminution de la concentration de l’enzyme actif.
Les inhibiteurs réversibles interagissent avec les enzymes par des réactions d’association/dissociation sans formation de liaisons stables. Au contraire, l’inhibition irréversible se manifeste généralement par la formation de liaisons covalentes stables avec l’enzyme.

Les inhibiteurs réversibles

Les inhibiteurs compétitifs

Ce sont des composés dont la structure ressemble à celle du substrat. Ils se combinent à l’enzyme au lieu et place de ce dernier et présente une affinité parfois plus élevée que celle du substrat naturel. Les inhibiteurs compétitifs sont donc des analogues stériques du substrat.
Tout se passe comme si l’enzyme ne faisait pas de distinction entre les deux composés de structure voisine et formait un complexe avec l’inhibiteur au lieu du substrat ; le degré de l’inhibition repose sur le rapport de concentration inhibiteur/substrat.

Les ions

Ils peuvent jouer un rôle d’activateur ou d’inhibiteur par des mécanismes différents. La plupart du temps, ils participent à la reconnaissance du substrat et jouent un rôle dans la structuration, enstabilisant la conformation du site actif.
Comme activateur, l’exemple le plus classique est celui des ions Mg ++ qui sont indispensable dans les réactions de phosphoryle, en particulier ceux mettant en jeu l’ADP et l’ATP.

Les effecteurs allostériques et l’enzyme de régulation

Les effecteurs allostériques sont les plus intéressants de tous les effecteurs. Ils jouent un rôle très important dans la régulation de l’activité métabolique des enzymes ; ils sont en règle générale, des métabolites sans aucune analogie structurale avec le substrat de la réaction. L’allostérie-autre conformation- implique l’interaction de plusieurs petites molécules sur des sites différents du site actif.
La cinétique des inhibiteurs ou activateurs allostériques,n’obéit pas à la loi de Michaélis : la courbe de la vitesse en fonction de la concentration en substrat, au lieu d’être hyperbolique est sigmoïde.
Cette allure sigmoïde est interprétée comme due à l’effet des premières molécules qui activent l’enzyme ; elles augmentent son affinité pour les molécules du substrat : il y a un effet coopératif du substrat. Cet effet coopératif peut disparaître lorsque l’on soumet l’enzyme à un chauffage modéré ou lorsque l’on ajoute des ions lourds ou des agents dénaturants. On a alors une cinétique michaélienne (C’est la dénaturation de l’enzyme).
L’addition d’un activateur allostérique déplace la courbe vers la gauche alors que celle d’un inhibiteur tend aucontraire à aplatir la courbeen la déplaçant vers ladroite.

Activateurs allostériques

Ils jouent un rôle analogue dans la régulation métabolique en permettant la transconformation d’une enzyme au repos en enzyme active.
Ex : la phosphorylase b inactive est transformée en phosphorylase b active par l’AMPc (acide adénilique).
La transconformation d’une enzyme inactive en enzyme active peut également résulter de l’élimination d’un inhibiteur par une petite molécule organique comme l’adénylate cyclase (AMPc) produite à la suite d’une incitation hormonale
C’est ainsi que l’adrénaline en provoquant la synthèsed’AMPc, permet l’activation de la protéine kinase et déclenche la glycolyse dans le tissu hépatique.
Les activateurs allostériques sont souvent des composés qui témoignent de l’insuffisante synthèse d’un composé important : l’effet d’activation favorise la synthèse de ce composé.

L’enzyme allostérique

Les enzymes allostériques possèdent deux types de site :
– le site actif qui se combine avec le substrat et catalyse la réaction enzymatique ;
– les sites de régulations qui peuvent se combiner à un effecteur : soit un activateur ou soit un inhibiteur.
Ces enzymes sont formées de plusieurs sub-unités identiques appelées protomères qui sont formé d’une ou de plusieurs chaînes polypeptidiques chacun. Ces protomères sont associées de sorte qu’ils occupent des positions équivalentes, lamolécule possédant un axe de symétrie. Chaque protomère possède un seul sitecatalytique et un seul site pour chaque type d’effecteur au maximum.
L’enzyme existe en deux état qui sont en équilibre : un état catalytique(R ou relax) et un état inhibé (T ou tense).Dans l’état catalytique, la forme de l’enzyme lui permet de se combiner au substrat et à l’activateur. Dans l’état inhibé, seul l’inhibiteur peut se fixer. Le passage d’une forme à une autre est appelé transitionallostérique.
Ainsi, l’enzyme existe sous deux formesen équilibre et selon que l’on ajoute du substrat et de l’activateur ou l’inhibiteur, on déplace cet équilibre vers une forme de l’enzyme

Table des matières
INTRODUCTION 
PREMIERE PARTIE GENERALITES SUR LES ENZYMES
I. Historique
II. Enzymologie
1. Définition de l’enzyme
2. Structure des enzymes
2. 1. Structure primaire
2. 2. Structure secondaire
2. 3. Structures tertiaire et quaternaire
3. Les cofacteurs enzymatiques
3. 1. Coenzymes d’oxydoréduction
3. 2. Coenzymes de transfert de groupements
3. 3. Cofacteurs métalliques
4. Le site actif
4. 1. Un microenvironnement d’où l’eau est exclu
4. 2. Des forces d’interaction faibles
4. 3. Un nombre limité de résidus impliqués dans la reconnaissance
4. 4. Une complémentarité stéréospécifique
5. Propriétés générales des enzymes
5. 1. Enzymes, des Catalyseurs
5. 2. Spécificité des enzymes
5. 2. 1. Spécificité de réaction
5. 2. 2. Spécificité du substrat
5. 3. Influences des facteurs physiques
5. 3. 1. Influence de la température
5. 3. 2. Influence de la pression et des radiations
5. 3. 3. Influence du pH
5. 4. Influences des facteurs chimique : les effecteurs
5. 4. 1 : Les inhibiteurs
5. 4. 1. 1. Les inhibiteurs réversibles
5. 4. 1. 2. Les inhibiteurs irréversibles
5. 4. 2. Les activateurs
5. 4. 2. 1. Les coenzymes
5. 4. 2. 2. Les kinases et proenzymes
5. 4. 2. 3. Activation par action sur les sous unités enzymatiques
5. 4. 2. 4. Activation par phosphorylation ou déphosphorylation del’enzyme
5. 4. 2. 5. Activation par protection de l’enzyme
5. 4. 3. Les ions
5. 4. 4. Les effecteurs allostériques et l’enzyme de régulation
5. 4. 4. 1. L’inhibition allostérique
5. 4. 4. 2. Activateurs allostériques
5. 4. 4. 3. L’enzyme allostérique
III. NOMENCLATURE – CLASSIFICATION
1. EC1. Les oxydoréductases
1. 1. Les déshydrogénases
1. 2. Les oxydases
1. 3. Les hydroxylases
1. 4. Les peroxydases
1. 5. Les catalases
2. EC2. Les transférases ou phérases
2. 1. Groupes monocarbonés
2. 2. Groupes aldéhydiques ou cétonques
2. 3. Groupes acyles
2. 4. Groupes glycosyle –Glcosyltransérases
2. 5. Groupes alcoyle (alkye)
2. 6. Groupes azotés
2. 7. Groupes phosphorés
2. 8. Groupes soufrés
3. EC3. Les hydrolases
3. 1. Les estérases
3. 2. Les osidases
3. 3. Les désacylases
3. 4. Les désaminases, amidases et amidinases
4. EC4. Les lyases
4. 1. Les carboxylases ou décarboxylases
4. 2. Les aldéhyde-lyases et cétone-lyases (ou cétolases)
4. 3. Les hydro-lyases ou hydratases
4. 4. Les ammoniac-lyases
5. EC5. Les isomérases
6. EC6. Les ligases ou synthétases
DEUXIEME PARTIE : SOURCES ET APPLICATIONS DES ENZYMES
I : Introduction
II. Préparation, isolement et dosage des enzymes
III : Production et applications d’une enzyme d’origine végétale
1. La PAPAÏNE 53
1. 1. Définition 53
1. 2. Historique 53
1. 3. Production 54
1. 4. Biochimie
1. 5. Domaines d’applications de la papaïne
1. 5. 1. Posologie
1. 5. 2. Domaine pharmaceutique
1. 5. 2. 1. Indications
1. 5. 2. 2. Recherches
1. 5. 2. 3. Précautions
1.5.3. Domaine alimentaire
1.5.4. Domaine du textile
1.5.5. Divers
IV. Production et applications d’une enzyme d’origine animale : la PEPSINE
1. Définition
2. Précurseur
3. Structure de la pepsine
4. Production
5. Biochimie
6. Domaine d’application de la pepsine
V. Biotechnologie enzymatique
1. Introduction
2. Définition de l’enzyme recherchée
3. Sélection d’une souche microbienne
3.1. Les mutations
3.2. Le génie génétique
4. Production
4.1. Préparation de l’inoculum
4.2. Composition du milieu de culture
4.3. La fermentation et les équipements
5. Extraction et purification
VI. Le dosage des enzymes
1. Méthodes de dosage des enzymes
1. 1. Dosage par cinétique
1. 2. Dosage à temps fixe
1. 3. Méthodes d’études des réactions rapides
VII. Domaines d’applications des enzymes
1. Enzymes dérivées de la biotechnologie etutilisées dans l’industrie des pâtes et papiers
2. Enzymes dérivées de la biotechnologie et les textiles
3. Des enzymes sont fréquemment utilisées dans les détergents à lessive
4. Enzymes dérivées de la biotechnologie et les biocarburants
5. Biotechnologie alimentaire
5. 1. Utilisation des enzymes dans les réactions de synthèse
5. 1. 1. Synthèse de composés responsables de la flaveur et des arômes
5. 1. 2. Synthèse de composés exhausteurs de goût
5. 1. 3. Production d’acides organiques et d’acides aminés
5. 1. 4. Synthèse d’édulcorants
5. 2. Utilisation des enzymes dans le procédé de transformation des matières naturelles alimentaires
5. 2. 1. Utilisation des enzymes dansl’industrie laitière
5. 2. 2. Utilisation des enzymes en panification et biscuiterie
5. 2. 3. Utilisation des enzymes pour la préparation des sucres alimentaires
5. 2. 4. Enzymes et technologie des boissons
5. 3. Enzymes et technologie des viandes
5. 4. Conclusion
6. Applications des enzymes dans le domaine biomédical
7. Enzymes et environnement – Application en toxicologie
8. Application en électrochimie d’enzymes
VIII. Production et applications d’enzymes d’origine marine et hydrothermale
IX. Enzymes de restriction
1. Généralité
2. Origine des enzymes de restriction
3. Nomenclature des enzymes derestriction
4. Types de coupures réalisées par les enzymes de restriction
5. Rôle biologique
6. Propriétés
7. Séquences d’ADN reconnues par les enzymes de restriction
8. Méthylation des sites de restriction et inactivation des enzymes de restriction
9. Utilisation des enzymes de restriction
REMARQUES 
CONCLUSION 

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