Production d’inoculum de la souche F. graminearum

Production d’inoculum de la souche F. graminearum

Production d’inoculum de la souche F. graminearum

Description de la souche Fusarium T10008

La souche F. graminearum T10008 est fournie par le laboratoire pathologie d’Arvalis Institut du Végétal à Grignon. C’est une souche qui a été choisie pour son efficacité d’infection importante et qui a été utilisée dans les essais officiels du CTPS. Ce microorganisme fongique appartient au genre Fusarium, et a été cultivé sur un milieu synthétique (PDA) dans les conditions de multiplication in vitro. Le développement mycélien de ce dernier est abondant et rapide, il se caractérise par une couleur blanc-rosé en début de culture puis rouge carmin avec des reflets jaunes sur les cultures plus âgées (Figure 2). Cette pigmentation est due aux anthocyanes produites par le champignon et la couleur peut varier selon le pH du milieu ainsi que les conditions de culture. L’observation directe du mycélium sous une loupe binoculaire permet de distinguer des structures fongiques appelées sporodochies, apparaissant sous forme d’agglomérats translucides gélatineux (Figure 3). Ces structures renferment les macroconidies, encore appelés spores (Figure 4), qui sont de forme allongée, arquée et comportant 3 à 6 cloisons. Elles peuvent aller d’une taille de 25 à 60µm.

Protocole de multiplication

Le protocole de multiplication suivi lors de cette étude est issu d’un protocole de laboratoire réalisé en routine à l’institut technique Arvalis. L’intérêt de ce protocole est de multiplier à grande échelle la souche F. graminearum T10008 et de favoriser sa sporulation afin d’obtenir une solution d’inoculum concentrée. La multiplication de micro-organismes fongiques nécessite des conditions de travail strictes et exemptes de tout autre microorganisme que celui que nous cherchons à cultiver. Ainsi, le matériel et les milieux de culture utilisés sont stérilisés, et toutes les manipulations sont effectuées sous bec bunsen. En outre, le genre Fusarium ne requiert pas de conditions de cultures particulières et se multiplie aisément sur milieu PDA à pH neutre en chambre d’incubation. La chambre d’incubation est paramétrée avec une humidité relative de 70%, une température de 20°C et une alternance d’éclairement jour/nuit de 12h. Sur les conseils de l’institut Arvalis, le type de néons d’éclairage sont des OsramL 58w/640 white et OsramL 58w/76 Natural. Le protocole est conçu en cinq étapes, à partir d’une culture isolée de Fusarium sur milieu gélosé.
 1ère étape : Mise en place des cultures mères
Un cube de gélose, environ 1cm de côté, issu de la culture isolée de F. graminearum T10008 (envoyé par Arvalis) est déposé au centre de la boite de pétri. Les boites inoculées sont mises en chambre d’incubation pendant une période de 8 à 10 jours. Les boites sont observées régulièrement pour voir l’apparition de sporodochies et moduler le temps d’incubation en fonction de l’état d’avancement.
 2ème étape : Mise en place des cultures filles À partir des cultures mères, les sporodochies sont récupérées à l’aide d’un scalpel ou un râteau en verre et 200µl d’eau osmosée stérile. La suspension de sporodochies est récupérée avec un pipetman puis dissoute à 50ml d’eau osmosée. Sur chaque boite fille, 200µl de solution diluée de sporodochies est étalée au râteau sur l’ensemble de la boite. Les boites filles inoculées sont placées en chambre d’incubation, directement sous l’éclairage sans les caches de protection des néons, durant 8 jours. La sporulation des boites est observable quand elles ont un aspect marron-orangé (Figure 5) avec parfois un développement mycélien plus ou moins abondant. Selon l’état d’avancement, cette sporulation peut être observée dès le sixième jour d’incubation.
 3ème étape : Récupération des spores Les spores de Fusarium sont récupérées à l’aide d’une solution de Tween20 à 0.05%. Fortement dilué, le Tween20 est un détergent qui permet d’éviter la formation d’agrégats de spores. Ces agrégats perturbent le comptage à la titration de l’inoculum et bouchent les buses du pulvérisateur lors de l’application. Le Tween20 est un produit très visqueux et difficile à prélever, sa dilution est approximative en ajoutant une à deux gouttes de produit dans 500 ml d’eau osmosée. De 2 à 5 ml de solution de Tween20 à 0.05% ont été déposés dans chaque boite fille, selon la quantité de mycélium présente. La solution est répartie sur l’ensemble de la boite puis la gélose est raclée à l’aide d’un râteau en verre afin de récupérer les spores. La suspension de spores est récupérée, sans prendre le mycélium, avec une pipette et placée dans une bouteille en verre, préalablement stérilisée. En cas de mycélium trop abondant, un tamis stérile est utilisé pour récupérer uniquement la solution d’inoculum. Une deuxième récupération peut être effectuée selon l’état de sporulation de la boite avec l’ajout d’un millilitre de solution Tween à 0.05%.  4ème étape : Titration de la solution d’inoculum Afin de déterminer la concentration en spores de la solution d’inoculum récupérée, une titration sur cellule de Nageotte est effectuée. Au préalable, une dilution au 1/10e ou 1/100e de l’inoculum dans de l’eau est souvent nécessaire afin de permettre le dénombrement des spores. La solution est placée entre la lame et la lamelle de la cellule puis le dénombrement des spores s’effectue sous microscope au grossissement x100. Le dénombrement est réalisé selon une méthodologie précise consistant à compter les spores présentes dans un espace quadrillé, défini par 40 bandes de dimensions10x0,25×0,50 mm (Figure 6). Ainsi la concentration finale de la solution sera déterminée par la formule suivante : C=(N/V)xD ; où C est la concentration en spores/ml, N est le nombre de spores, V le volume de comptage et D la dilution effectuée.
 5ème étape : Conservation de l’inoculum
Afin de préserver au mieux la viabilité des spores et limiter les lésions membranaires causées par les conditions de congélation à -20°C, la solution d’inoculum doit être mélangée à un milieu de congélation composé de lait et de glycérol. Le lait sert de support nutritif aux spores en sortie de décongélation afin d’assurer une bonne reprise de l’activité germinative et infectieuse. La préparation du lait est réalisée à partir de 30 mg de lait écrémé en poudre, ajouté à 276 ml d’eau osmosée. Le lait réhydraté est stérilisé à l’autoclave 20 min à 120°C.
Le glycérol doit représenter 10% du volume total de lait soit 30ml de glycérol pour 300ml de lait réhydraté. Une fois le milieu de congélation prêt, il est ajouté à volume égal de la solution d’inoculum puis congelé à -20°C.

Table des matières

I. Introduction
1. Les perspectives agricoles
2. Contexte de l’étude
3. Étude bibliographique
3.1 La fusariose de l’épi de blé
3.2 Les mycotoxines produites par F.graminearum
3.3 Les études de cartographie QTL sur la résistance à la fusariose
3.4 Les études de génétique d’association pour le caractère FHB
4. Problématique de l’étude
II. Matériels et méthodes
1. Production d’inoculum de la souche F. graminearum
1.1 Description de la souche Fusarium T10008
1.2 Protocole de multiplication
2. Essai expérimental
2.1 Matériel végétal (220 variétés)
2.2 Dispositif Expérimental
2.3 Itinéraire technique
3. Inoculation Parcellaire
4. Notations
4.1 Épiaison/Floraison
4.2 Symptômes et méthodologie de notation de la maladie FHB
5. Analyses statistiques des données phénotypiques
6. Démarche de la génétique d’association (GWAS)
6.1 Principe général et Concepts de base
6.2 Données de Génotypages
6.3 Déséquilibre de liaison
6.4 Structuration de la population d’étude
6.5 Modèles statistiques d’association
III. Résultats
1. Analyse des données de phénotypages
1.1 Vérification de l’effet terrain
1.2 Validité des témoins
1.3 Cotation et classification variétale
2. Structuration de la population
3. Déséquilibre de liaison des chromosomes 3B et 4B
4. Résultats d’association génétique sur le chromosome 3B
5. Résultat d’association génétique sur le chromosome 4B
6. Effet allélique des marqueurs associés
IV. Discussion
1. Variabilité du caractère étudié
2. Stratification de la population d’étude
3. Résolution du déséquilibre de liaison
4. Associations génétiques établies sur les chromosomes 3B et 4B
Conclusion
Références Bibliographiques
Annexes

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