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Production de boissons alcoolisées grâce à Saccharomyces cerevisiae Bières
Pour obtenir le moût qui servira de milieu nutritif à la levure, la céréale (orge, froment, avoine, blé, seigle, maïs, ou riz), matière première non fermentescible par la levure, est mise à germer, ce qui provoque la décomposition de l’amidon en sucres, notamment le maltose, grâce à des enzymes sécrétées par la céréale elle-même. La céréale ainsi transformée s’appelle malt. Les enzymes ne sont qu’en partie dégradées par la chaleur. Cette opération s’appelle le touraillage. Le malt ainsi produit est chauffé avec du houblon pour les bières européennes ou américaines, dans l’eau pour dissoudre les sucres produits. Le mélange après avoir été clarifié est ensemencé de levure, démarrant ainsi le processus de fermentation en décomposant le maltose en éthanol et dioxyde de carbone.
Deux types de levures sont utilisés : Saccharomyces cerevisiae pour la fermentation haute, menée autour de 20 °C, où la levure retient une partie du gaz et finit par flotter à la surface et Saccharomyces uvarum et pastorianus pour la fermentation basse, menée au-dessous de 10 °C, la levure se dépose et s’accumule alors en fond de cuve en fin de fermentation, d’où leur nom. L’éthanol et le dioxyde de carbone restent dans la bière ce qui lui donnera son pétillant et sa mousse (Association des Brasseurs de France, 2016; Brasseurs de France, 2016; Univers biere, 2016). Saccharomyces cerevisiae se singularise par le fait que le transport du maltose demeure élevé en aérobiose et que la respiration se situe à un niveau suffisamment bas pour que la fermentation aérobie puisse avoir lieu.
La fabrication débute après la récolte en écrasant ou en broyant les pommes afin que le jus puisse plus facilement être extrait lors de l’étape suivante, le pressurage, qui consiste à exercer une forte pression sur les pommes broyées afin d’en extraire le jus.
A noter que tout comme lors du pressurage du raisin, le résidu de pomme pressée obtenu s’appelle le « marc », il est bien souvent considéré comme un déchet au même titre que les sous-produits de fermentation en brasserie qui ne sont que très peu traités alors que les graines solides restantes, les peaux et la pulpe contiennent encore de nombreux composés, polyphénols et antioxydants, aux multiples vertus et des molécules pouvant être utilisées en alimentation animale et comme matières premières en bio-raffinerie (Xiros & Christakopoulos, 2012).
Le jus sucré obtenu après le pressurage des pommes fermente rapidement et est entreposé dans une cuve à une température d’environ 15°C dans un environnement sec en contact avec de l’air. Après quelques semaines, des étapes simples de purification sont réalisées (soutirage, défécation ou clarification).
Le moment de la mise en bouteille arrive avec une seconde fermentation pour les cidres dits « fermiers » qui entraînera la « prise de mousse » (la formation de bulles) ; pour les cidres industriels clarifiés, des levures sont ajoutées et leur développement est contrôlé très précisément par le biais de la température, ce qui permettra d’arriver au produit souhaité (doux, brut, traditionnel…), puis du gaz carbonique est injecté au moment de la mise en bouteille (Pole Fruitier de Bretagne, 2016; Veron, 2006). Vins Vins tranquilles
La matière première pour la fabrication du vin est le jus de raisin. La levure peut fermenter ce dernier jusqu’à une concentration de 250 g/L de saccharose ; au-delà, comme vu précédemment, la pression osmotique est trop importante et endommage les cellules. De la même façon la concentration en éthanol que la levure peut supporter (140 g/L soit environ 18% vol.) est limitée (Ribéreau-Gayon, Glories, Maujean, & Dubourdieu, 2006). En fin de vinification, une atmosphère réductrice est souvent maintenue, par isolation de l’air, afin que l’acétaldéhyde soit hydrogéné en éthanol, entraînant une légère production d’éthanol supplémentaire. Ceci permet d’éliminer l’acétaldéhyde, molécule extrêmement toxique pour les cellules (réaction spontanée à pH7 avec les groupements NH2 des protéines rendant ces dernières inactives) et a aussi l’avantage d’empêcher l’oxydation des arômes, ainsi que l’oxydation de l’alcool en acide acétique par des bactéries. (Fugelsang & Edwards, 2007; Nerantzis, Tataridis, Sianoudis, Ziani, & Tegou, 2007).
En 2015, la production mondiale de vin, hors jus et moûts, atteignait 275,7 millions d’hectolitres, en légère hausse de 2% par rapport à 2014, selon les premières estimations de l’Organisation Internationale de la vigne et du vin (OIV), mais plutôt stable sur les dix dernières années.
La production des vins tranquilles dans le monde reste stable et représente encore la majeure partie de la production de vins, environ quinze fois plus que les vins effervescents (275 contre 18 millions) (Bechet, 2016). Les chiffres montrent tout de même une légère tendance des consommateurs à moins consommer de vins tranquilles (FranceAgriMer, 2016b).
A noter que la consommation des vins bio augmente de 13% par an ces dernières années (Vignes et vins magazine). Vins effervescents
Il existe différents types de vins effervescents : les vins mousseux, les vins pétillants et les vins perlants. La distinction entre ces derniers s’effectue sur la base de la surpression en bouteille (ou autre conditionnement) due au gaz carbonique introduit ou produit lors de la fermentation, selon la méthode d’élaboration. Selon la réglementation européenne, la surpression doit, pour les vins mousseux, être supérieure à 3 bars et pour les vins pétillants, être comprise entre 1 et 3 bars. Non définis dans la réglementation, les vins perlants sont difficiles à identifier ; par défaut, ils accusent en bouteille une surpression inférieure à 1 bar (Breban, 2016; FranceAgriMer, 2016a).
La fabrication des vins mousseux qui représentent la majeure partie des vins effervescents, repose dans un premier temps sur la même méthode que celle d’un vin tranquille auquel on fait subir une seconde fermentation alcoolique par l’ajout de levures et de sucre (Figure 2). Lors de cette seconde fermentation en vase clos, la concentration en éthanol augmente et le dioxyde de carbone produit est dissous dans le liquide, grâce à une augmentation de la pression du gaz surnageant ; ceci donnera les bulles bien connues des vins effervescents, produites lors du débouchage et de la détente à la pression atmosphérique du vin.
Sur l’année 2014, la France a exporté 1,65 million d’hectolitres, soit 50% de la production nationale de vins effervescents, dont 70% de champagne, ce qui représente en volume presque un quart des exportations mondiales. Les principaux importateurs de vins effervescents français sont le Royaume-Uni (20% des volumes exportés), les Etats-Unis (14%) et l’Allemagne (un peu moins de 14%).
En 2014, la production de vins effervescents a suivi la tendance de la production mondiale de vins. La part des vins effervescents représente environ 7 % de la production totale de vins dans le monde, avec une légère augmentation depuis plusieurs années. Cette production annuelle atteint en moyenne 18 millions d’hectolitres ces dernières années, ce qui représente un peu plus de 2,5 milliards de cols.
D’après le dernier rapport de FranceAgriMer (2016), la consommation mondiale de vins effervescents continue de croître, plus rapidement que celle des vins tranquilles. Elle représente 17,6 millions d’hL en 2014, soit une croissance de 4,1% entre 2005 et 2014, alors que sur la même période la croissance de la consommation de vins tranquilles n’est que de 1,3%. Les vins effervescents représentent 7% de la consommation globale de vins dans le monde, cette tendance est très encourageante pour la filière française de production de vins effervescents, et la Champagne en tout premier lieu.
Le métabolisme de la levure
Le principal métabolisme de la levure est le métabolisme carboné central comprenant la glycolyse, la voie éthanol, le cycle de Krebs ou cycle de l’acide citrique (Tricarboxylic Acid (TCA) cycle) et la voie des pentoses phosphates. Le fonctionnement du métabolisme reste cependant relativement méconnu du fait de sa complexité avec ses nombreuses réactions et voies interconnectées, le produit de l’une étant souvent le réactif de l’autre. De plus, en fonction de la disponibilité en oxygène, S. cerevisiae étant un micro-organisme aérobie facultatif et Crabtree positif (cf. définition 4.7.2, page 28), elle présente la caractéristique de convertir rapidement les sucres en éthanol et dioxyde de carbone, à la fois en conditions anaérobies et aérobies.
La production de biomasse à partir de Saccharomyces cerevisiae est un procédé aérobie nécessitant un catabolisme oxydatif du substrat. Néanmoins, S.cerevisiae peut également présenter un métabolisme mixte qui lui permet de réaliser simultanément suivant différentes proportions la respiration et la fermentation en milieu aérobie quand la concentration en glucose dépasse un seuil critique. En métabolisme respiro-fermentaire, seulement un peu plus de 3 % des atomes de carbone sont « respirés » (Gancedo, 1998; Rodrigues, Ludovico, & Leão, 2006; Van Dijken, Weusthuis, & Pronk, 1993). Ce phénomène appelé effet Crabtree provoque une production d’éthanol même en présence d’oxygène, ainsi qu’une baisse du rendement de conversion du glucose en biomasse dont nous parlerons dans le paragraphe 4.7.2 (page 28). Besoins nutritionnels
Pour se développer la levure Saccharomyces cerevisiae a besoin d’une source carbonée (sucres, glycérol ou éthanol principalement) et d’autres composés en plus faibles quantités tels que, par ordre d’importance décroissant, l’azote, le phosphore et le soufre. La levure est capable d’assimiler le phosphate et le soufre inorganiques, elle est donc autotrophe pour ces éléments.
Viennent ensuite plus généralement :
– Les micronutriments, substances sans valeur énergétique, mais indispensables en très petites quantités au fonctionnement du métabolisme ; ils servent principalement de cofacteurs aux enzymes. Ils regroupent certains acides aminés que la levure ne sait pas synthétiser, les vitamines et les oligoéléments (Cu2+, F-, Zn2+, I-, Se2-, Mn2+, …). Ces derniers sont actifs à de très faibles concentrations (0,1 à 100 μM), mais inhibiteurs au-dessus d’une certaine concentration (10 à 100 mM) (Dombek & Ingram, 1986).
– Les macronutriments, substances requises en plus grande quantité (0,1 à 1mM) car servant à la structure de la levure et comme source d’énergie. On y retrouve de nombreux acides aminés, les protéines, lipides, glucides et minéraux (Na+, Mg2+, K+, Ca2+, Fe2+, Fe3+, P3-, S2-, Cl-, …). Parmi les espèces majeures présentes dans un milieu de culture, on s’attardera plus spécifiquement sur l’azote, le phosphore et le soufre.
Chez les levures, un peu moins de 10% de la masse sèche de la cellule est de l’azote ; celui-ci doit donc être présent dans le milieu de culture pour être assimilé (Thomas & Ingeldew, 1992). Dans les conditions de fermentation habituelles, une quantité importante d’azote extracellulaire est apportée sous forme de sels d’ammonium (phosphate, sulfate ou chlorure).
Le phosphore est très souvent assimilé sous forme de phosphate inorganique, l’ion PO42- est la source de phosphate la plus facilement assimilable, son assimilation se fait toujours via l’ATP synthétase selon la réaction : ADP + PO42- => ATP
Cette réaction se rencontre dans plusieurs étapes du métabolisme : en aérobiose lors du rééquilibrage de la force proton motrice de la chaîne respiratoire, en anaérobiose lors de la fermentation alcoolique et dans tous les cas lors de la glycolyse. De plus, sous l’effet d’enzymes de type phosphotransférase, des groupes PO42- peuvent être transférés à partir d’ATP ou de phosphoénolpyruvate (PEP) (Annexe 1 : Métabolisme carboné central de Saccharomyces cerevisiae, d’après Larpent (1990)).
Enfin le soufre organique provient des acides aminés soufrés mais généralement le soufre est assimilé plutôt sous forme inorganique, la seule forme utilisée par la levure étant SO42-.
On alimente la culture la plupart du temps avec du sulfate d’ammonium ((NH4+)2SO42- ) qui apporte simultanément soufre et azote ; si le milieu contient de l’azote aminé on met du phosphate diammonique ((NH4+)2HPO42-) pour apporter du phosphate (cas usuel dans les fermentations viniques, des SO2 étant apportés lors du sulfitage des moût).
Pour obtenir un taux de croissance maximal, il est nécessaire d’ajouter des facteurs de croissance tels que des vitamines que la levure ne sait pas synthétiser (biotine et thiamine par exemple).
Pour se nourrir la levure puise dans le milieu de culture les éléments indispensables présents, qui sont stockés, dans la vacuole principalement, soit complexés par des chélatants, soit directement utilisés par les voies anaboliques ou cataboliques de son métabolisme. Il existe quatre mécanismes qui régulent l’entrée et la sortie des métabolites : la diffusion simple, la diffusion facilitée, le transport dans des canaux de diffusion et le transport actif simple ou avec translocation de groupe (cas de l’entrée des sucres, c’est pour cela que l’on trouve du glucose-6-phosphate (G6P) au départ de toute les voies métaboliques, le glucose étant phosphorylé en position 6 lors du transport transmembranaire). Le métabolisme oxydatif
Ce métabolisme permet la multiplication par bourgeonnement ; il s’agit de l’un des métabolismes apportant le plus d’énergie sous forme d’ATP, avec un rendement cellulaire important. Il repose sur la production de biomasse et de dioxyde de carbone grâce à l’oxydation complète du glucose via les voies métaboliques de la glycolyse (Figure 4 et Annexe 1 : Métabolisme carboné central de Saccharomyces cerevisiae, d’après Larpent (1990)), du cycle de Krebs (Figure 4 et Annexe 2 : Détail du métabolisme carboné central de la mitochondrie d’après Larpent (1990) et de la phosphorylation oxydative. Pour cela, la concentration en oxygène disponible doit être la plus élevée possible tandis que la concentration en substrat doit être constante, mais plutôt faible (50 à 150 mg/L environ) (Larpent, 1990; Sanchez Gonsalez, 2008).
En métabolisme oxydatif, le rendement de production de biomasse théorique est, à son maximum, de l’ordre de 0,5 g de matière sèche/gramme de glucose consommé, le quotient respiratoire (QR=???????é ?? ??????? ?? ??????????????é ?? ??????è??) est voisin de l’unité et l’éthanol n’est détecté qu’à l’état de traces (Käppeli, 1986; Käppeli & Sonnleitner, 1986; Larpent, 1990). Dans ces conditions, les cofacteurs réduits NADH et FADH2 produits par la glycolyse et le cycle de Krebs sont réoxydés au niveau de la chaîne respiratoire (Celton, 2011; Ehsani, Fernández, Biosca, & Dequin, 2009).
L’équation suivante présente le bilan global théorique de cette voie métabolique : C6H12O6 + 6O2 + 36 Pi + 36 ADP => 6 CO2 + 6 H2O + 36 ATP + chaleur (1554 kJ) Le métabolisme fermentaire
Le métabolisme fermentaire est réalisé en absence d’oxygène, le rendement de conversion de biomasse à partir du glucose est divisé par 5 par rapport aux conditions aérobies et 18 fois moins d’ATP est produit (Bakker et al., 2001; C. Verduyn, Stouthamer, Scheffers, & Van Dijken, 1991).
La glycolyse, étape commune à la fermentation et à la respiration, produit 2 moles d’ATP, 2 moles de pyruvate et 2 moles de NADH à partir de la dégradation d’une mole de glucose. La conversion du pyruvate en éthanol permet de réoxyder une molécule de NADH (Annexe 1 : Métabolisme carboné central de Saccharomyces cerevisiae, d’après Larpent (1990)). Du point de vue oxydo-réduction, le bilan de la transformation de glucose en éthanol est nul.
L’équation globale de la fermentation est la suivante : C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP => 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP + chaleur
Pour ce métabolisme, le rendement théorique de conversion du glucose en éthanol est de 0,511 g éthanol/g glucose (Jacobson, 2006; Jacques, Lyons, & Kelsall, 2003, p. 163), mais la formation de composés secondaires, les réactions de maintenance et la synthèse des constituants cellulaires le limitent en pratique dans une gamme de 0,1 à 0,5 g éthanol/g glucose selon les souches (Käppeli, 1986). Le rendement de glycérol est de 0,027 g glycérol/g glucose à 27°C (Anne-Sophie Aldiguier, 2006), l’un des rôles du glycérol étant de rééquilibrer la balance rédox de la cellule (Nevoigt & Stahl, 1997), il sera d’autant plus élevé lors de la fermentation par rapport à la respiration.
Le rendement en biomasse, de l’ordre de 10% (0,1 g de matière sèche par gramme de glucose consommé), est beaucoup plus faible qu’en métabolisme oxydatif (0,5 g matière sèche/g glucose) (Käppeli & Sonnleitner, 1986), le restant étant incorporé dans l’éthanol, le glycérol et le pyruvate, parfois même dans le succinate (Fiechter & Seghezzi, 1992). Ce faible rendement peut s’expliquer par la chaîne respiratoire qui ne fonctionne pas en absence d’oxygène ce qui entraîne la production de seulement 2 ATP. La croissance en anaérobiose n’est possible qu’avec les levures sensibles au glucose, mais l’apport d’ergostérol, d’acides gras insaturés et parfois de vitamines (acide nicotinique) est essentiel car ces molécules ne sont pas synthétisées dans ces conditions (Larpent, 1990).
En culture sur milieu non renouvelé, mais aéré, Saccharomyces cerevisiae qui est une levure sensible au glucose, montre une croissance de type diauxie (Figure 3). Quand la concentration en glucose est importante au départ, la croissance de la levure devient rapidement élevée atteignant un taux de croissance de 0,40 à 0,45 h-1. Le glucose réprime la respiration conduisant à l’accumulation de l’éthanol dans le milieu. Ainsi un rendement en biomasse faible (0,15 g matière sèche/g glucose) et un quotient respiratoire élevé sont les indicateurs d’un métabolisme fermentaire prédominant (Larpent, 1990).
Si plusieurs composés carbonés présents dans le milieu sont assimilés par des voies métaboliques différentes, à des vitesses différentes, on observe alors un phénomène de diauxie qui donne lieu à la courbe de croissance à deux phases (Figure 3).
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Table des matières
Introduction générale
Introduction générale, contexte de l’étude
Chapitre 1 : Synthèse bibliographique
Production de boissons alcoolisées grâce à Saccharomyces cerevisiae
Bières
Cidres
Vins
Le métabolisme de la levure
Besoins nutritionnels
Le métabolisme oxydatif
Le métabolisme fermentaire
Production et consommation de l’éthanol et du glycérol par Saccharomyces cerevisiae
Production et consommation du glycérol par Saccharomyces cerevisiae
La transition glycolyse-gluconéogenèse
Paramètres influençant l’activité levurienne
La température
Le pH
Apport en azote
L’oxygénation du milieu
Le dioxyde de soufre
Le dioxyde de carbone dissous
Effet glucose fermentation-respiration
Notion de stress chez les levures
Cinétique de croissance microbienne
Croissance microbienne en culture discontinue (batch)
Les différents types de culture
Le mode de culture discontinu (batch)
Le mode de culture discontinu alimenté (fed-batch)
Le mode de culture continu et à recyclage cellulaire (BRC)
Les levures sèches actives commerciales
Le bioréacteur
Dimensionnement d’un bioréacteur
Les approches de l’extrapolation
Les phénomènes de transfert
Production de chaleur lors de la croissance de Saccharomyces cerevisiae
L’énergie de maintenance
Energie-chaleur produite lors de fermentation
Energie-chaleur produite lors de respiration
Chapitre 2 : Matériel et méthodes
Milieux de culture
Caractéristiques du vin utilisé
Préparation des milieux en fiole Erlenmeyer
Préparation des milieux en bioréacteurs
Réhydratation-acclimatation et ensemencement
Culture en fiole Erlenmeyer
Mesures en fin de culture
Cinétique
Perte de masse et quantité de CO2 produit
Culture en bioréacteur batch
Le bioréacteur utilisé et les sondes de suivi
Détermination de la distribution des temps de séjour
Caractérisation rhéologique du milieu de culture
Analyse de la composition de l’air en sortie
Culture en bioréacteur fed-batch
Méthodes analytiques
Caractérisation de la biomasse
Dosage des sucres, de l’éthanol et du glycérol
Dosage des ions
Méthodes d’analyse des cinétiques
Régulation de l’ajout de substrat au cours de la culture fed-batch
Chapitre 3 : Résultats et discussion : Production de levure en milieu hydro-alcoolique
Introduction
Etude et optimisation des cultures en fioles Erlenmeyer
Réhydratation et inoculation des levures
Effet de la concentration en glucose et effet Crabtree
Influence de la concentration en azote
Influence de la nature de la source carbonée
Effet du pH
Essai de fermentation avec les levures produites par le procédé
Conclusion de la partie fioles Erlenmeyer
Etude en bioréacteur batch
Corrélations entre poids sec, absorbance et concentration cellulaire
Détermination de la distribution des temps de séjour
Influence de l’aération sur l’oxygénation du milieu
Calcul des kL a
Influence de l’aération sur les temps de doublement
Influence de l’aération sur la production de biomasse et consommation de glucose
Influence de l’aération sur les produits de fermentation
Vitesse spécifique de croissance
Détermination de la part de respiration et de fermentation dans les essais batch entre l’instant initial et celui où le glucose est épuisé
Conclusion
Production de levure en bioréacteur alimenté (fed-batch)
Optimisation de la phase de démarrage
Procédé mis en oeuvre pour la production de micro-organismes
Nouveau procédé de culture
Conclusion des essais fed-batch
Fed-batch pilote
Caractérisation rhéologique du milieu de culture
Schéma de procédé
Conclusion générale et perspectives
Conclusion générale
Références bibliographiques
Annexes
Annexe 1 : Métabolisme carboné central de Saccharomyces cerevisiae, d’après Larpent (1990)
Annexe 2 : Détail du métabolisme carboné central de la mitochondrie d’après Larpent (1990)
Annexe 3 : Détermination des vitesses spécifiques de croissance en réacteur batch
Annexe 4 : Calcul de l’évaporation d’éthanol dans le réacteur avec condenseur
Annexe 5 : Détermination des rendements éthanol à partir du glucose
Annexe 6 : Dessin de la cuve de stockage et mélange du milieu d’alimentation d’une contenance de 1000 litres
Annexe 7 : Dessin de la cuve de croissance d’une contenance de 800 litres
Annexe 8 : Représentation graphique de l’évolution du nombre de levures et de leur taille lors des prélèvements quotidiens lors d’un essai de fermentation aérée à 0,1VVm
Annexe 9 : Glossaire
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