Soutenance mémoire
Reconstitution des protéines
Production classique de protéines recombinantes
Les protéines membranaires sont produites naturellement dans des cellules ou des microorganismes. L’utilisation de méthodes de génie génétique, permettant de cloner et de sur-exprimer des gènes codant pour des protéines d’intérêt, permet l’obtention de plus grandes quantités de protéines et facilite les étapes de purification notamment si une étiquette a été rajoutée à la protéine (par exemple His ou G3T) en N ou C-terminal. Le choix de l’hôte (cellule de mammifère, bactérie, levure, champignon, insecte) pour la production de protéines est important. Il est dépendant des modifications posttraductionnelles nécessaires à de nombreuses protéines membranaires. Les bactéries n’étant pas capables de faire ce type de modifications, le choix de cellules eucaryotes peut être préféré.
Production de protéines recombinantes
Les protéines recombinantes sont couramment produites dans des microorganismes (bactéries, levures) . Le gène codant pour la protéine d’intérêt est inséré dans un vecteur de clonage. Les vecteurs de clonages sont en général issus de molécules naturelles tels les plasmides de bactéries ou les bactériophages, les plasmides étant les plus fréquemment employés. Le plasmide utilisé comme vecteur de clonage comporte une origine de réplication spécifique de l’hôte dans lequel sera inséré le fragment d’ADN, un gène de résistance (voire deux dans certains cas) à un antibiotique donné permettant la sélection des cellules contenant le plasmide et un site multiple de clonage (polylinker) reconnu par un certain nombres d’enzymes de restriction permettant d’ouvrir et de linéariser le plasmide circulaire. La protéine est produite dans l’hôte lorsque les conditions sont établies pour induire l’expression du gène correspondant. Une fois produites, les protéines doivent être purifiées afin de pouvoir étudier leurs propriétés biochimiques et enzymatiques .
Purification des protéines recombinantes
Plusieurs étapes de purification sont en général nécessaires pour obtenir une protéine donnée. Le nombre d’étapes dépend de la protéine mais aussi du degré de purification souhaité. En effet, des protéines utilisées à des fins thérapeutiques ou en cristallographie devront être extrêmement pures alors que pour l’étude cinétique d’une enzyme, un échantillon moins sélectif pourra être utilisé. L’étape initiale de toute purification cellulaire est d’extraire les protéines des cellules qui les contiennent. Elle consiste à casser les cellules contenant les protéines d’intérêt à l’aide de méthodes de broyage telle que la sonication avec des billes de verre ou la filtration. Cette étape de broyage est suivie d’une centrifugation à basse vitesse pour récupérer l’extrait cellulaire total » comprenant membranes et partie soluble. Les étapes suivantes sont dépendantes du type de protéines membranaires (intégrales ou périphériques) que l’on veut purifier. L’extraction est plus aisée dans le cas des protéines périphériques pour lesquelles les liaisons les reliant aux protéines intrinsèques ou aux lipides sont relativement faibles. Dans ce cas, une augmentation de la concentration ionique du tampon ou un changement de pH pourront par exemple être employés. Une fois cette extraction réalisée, les protéines extraites présentent les caractéristiques des protéines solubles, il est donc possible de les purifier avec des techniques de chromatographies conventionnelles adaptées à leurs propriétés (solubilité, charge, poids moléculaire, affinité, etc.).
Les protéines intégrales, quant à elles, nécessitent pour leur extraction des membranes l’utilisation de détergents afin de maintenir un environnement hydrophobe semblable à celui présent dans la membrane, tels que du sodium dodécyl sulfate (SDS), du sodium deoxycholate, du triton X-100. Une fois extraites elles pourront également être purifiées avec les mêmes techniques de chromatographies conventionnelles que celles utilisées pour les protéines périphériques. Néanmoins, dans leur cas, afin de maintenir la solubilité protéique, il est nécessaire d’inclure des détergents dans toutes les étapes du procédé de purification .
Système d’expression acellulaire
Lors de la production classique de protéines recombinantes, des problèmes de toxicité cellulaire peuvent survenir. S’ajoutent d’autres difficultés liées à leur structure complexe quand il s’agit de produire des protéines membranaires (faible rendement, agrégation protéique, mauvais repliement). Grâce aux avancées en biochimie et biologie moléculaire, une alternative à la synthèse classique de protéines recombinantes existe . Il s’agit de systèmes de transcription et de traduction acellulaires qui vont directement permettre la production de protéines sans nécessiter la conservation de cellules et la croissance cellulaire. Ainsi, les systèmes d’expression acellulaire ne sont pas affectés par la physiologie des cellules vivantes. En outre, ils permettent un accès plus facile à l’étude de plusieurs mécanismes cellulaires, de nombreux paramètres (concentrations de gènes, de polymérases, …) pouvant être contrôlés.
Principe du système d’expression acellulaire
Les premiers travaux sur la synthèse protéique remontent aux années 50. Dans les années 60, Niremberg et Matthaei ont mis au point un système traductionnel acellulaire basé sur l’utilisation d’ARNm ou de polyribonucléotides synthétiques. Puis des systèmes couplant les étapes de transcription et de traduction à partir d’ADN ont été développés pour atteindre à la fin des années 80, la forme que nous connaissons aujourd’hui. Ce système d’expression protéique acellulaire (CFPS) basé sur l’utilisation d’extraits cellulaires a d’abord été utilisé pour la production de protéines solubles . Son utilisation s’est démocratisée dans les années 2000 avec la commercialisation des kits RTS par la société Roche. C’est un système dont le haut potentiel ne cesse d’être démontré. En effet, depuis les années 2000, la capacité de produire des protéines membranaires a été mise en évidence. Plus récemment, la possibilité de synthétiser entièrement le bactériophage T7 a été démontrée par l’équipe de V. Noireaux. Ces systèmes dédiés à l’origine à une utilisation en laboratoire pour des raisons de coûts de production, peuvent depuis presque une décennie être utilisé en tant que plateforme de production de protéines à l’échelle industrielle .
Pour que les gènes soient exprimés, un système efficace in vitro pour les étapes de transcription d’ADN et de traduction d’ARNm est nécessaire. L’étape de traduction est la plus délicate puisqu’elle nécessite environ une centaine de composants (ribosomes, facteurs de traduction, ARNt, acides aminés, ATP, …) et des conditions de réactions dépendantes de l’ajustement des paramètres tels que les concentrations de magnésium et de potassium. Dans les systèmes d’expression protéique acellulaire, l’ADN sert de support de l’information génétique. Selon les équipes travaillant sur ces systèmes d’expression protéique, des différences peuvent être constatées. Certains systèmes utilisent des promoteurs T7, d’autres des promoteurs sigma 28. Les conditions expérimentales peuvent aussi varier. En guise d’illustration, des températures différentes peuvent être observées (29°C dans certains systèmes tandis que d’autres nécessitent une température de réaction de 37°C).
Plusieurs types de production sont utilisés : le mode batch et le mode en flux continu. La forme traditionnelle, mode batch, est le format de production le plus limité dans le temps. En effet, l’expression s’arrête au bout de quelques heures quand toutes les sources d’énergie nutritionnelles apportées en début de réaction ont été consommées, ceci a pour conséquence directe un rendement plus faible qu’un système en flux. Dans ce système, deux compartiments sont séparés par une membrane de dialyse de taille adaptée aux petites molécules. La solution tampon contient les substrats nutritionnels et énergétiques qui alimentent le compartiment dans lequel a lieu la réaction. Le système est donc supplémenté en énergie et en substrats. En outre, ce mode de production permet l’élimination des coproduits de réaction qui sont des « déchets » métaboliques se retrouvant dans le compartiment d’alimentation .
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Table des matières
INTRODUCTION
Partie I : Etat de l’Art, des membranes biologiques aux membranes biomimétiques intégrant des protéines membranaires
1. Contexte
2. La membrane biologique
2.1. Généralités
2.2. Les lipides
2.3. Les protéines membranaires
3. Des membranes biologiques aux modèles membranaires
3.1. Généralités
3.2. Les liposomes
3.3. Les membranes planes
4. Reconstitution des protéines
4.1. Production classique de protéines recombinantes
4.2. Système d’expression acellulaire
4.3. Intégration des protéines produites par CFPS dans des systèmes liposomes
5. Positionnement des travaux
6. Références
Partie II : Matériel et Méthodes
1. Préparation des plasmides
1.1. Souches et plasmides
1.2. Amplification plasmidique
1.3. Extraction plasmidique
1.4. Vérification de la taille des ADN plasmidiques
1.5. Détermination de la masse molaire des solutions plasmidiques
2. Expression de protéines in vitro
2.1. Extrait cellulaire utilisé
2.2. Préparation PGA
2.3. Préparation AA
2.4. Préparation du système d’expression protéique acellulaire
2.5. Vérification de la production de protéines
3. Préparation des solutions de liposomes
3.1. Lipides
3.2. Tampons utilisés pour la préparation des suspensions de liposomes
3.3. Préparation des solutions lipidiques
3.4. Préparation des liposomes
3.5. Caractérisation de la taille des liposomes
4. Formation d’une bicouche lipidique et incorporation de protéines produites par le système d’expression protéique acellulaire (CFPS)
4.1. Tampons utilisés
4.2. Caractérisation de la formation d’une bicouche lipidique par QCM-D
4.3. Caractérisation de la formation d’une bicouche lipidique par SPR
4.4. Caractérisation de la formation d’une bicouche lipidique par FRAP
4.5. Caractérisation de la formation d’une bicouche lipidique par AFM
5. Références
Partie III : Résultats et Discussion
Chapitre 1 : Incorporation de pores membranaires dans une bicouche phospholipidique supportée (SLB)
Remarques générales
1. Stratégie de construction de la membrane
1.1. Caractérisation de la formation de membrane par QCM-D
1.2. Caractérisation de la formation d’une SLB par FRAP
1.3. Caractérisation de la formation d’une SLB par AFM
1.4. Formation d’une SLB : conclusion
2. Insertion de pores membranaires dans une bicouche lipidique supportée (SLB)
2.1. Choix de l’Alpha Hémolysine et de l’Alpha Hémolysine-eGFP
2.2. Production et incorporation de protéines membranaires
2.3. Optimisation des paramètres du CFPS
3. Conclusion générale
4. Références
Chapitre 2 : Incorporation de protéines membranaires dans une bicouche lipidique espacées et ancrées (tBLMs)
1. Formation de tBLMs sur surface de SiO2
1.1. Stratégie de formation de tBLM avec l’espaceur PEG-OCH3 sur SiO2
1.2. Formation d’une tBLM avec un espaceur PEG-NH2
1.3. Conclusion
2. Formation de tBLM sur or et incorporation d’AqpZ
2.1. Adsorption des molécules DSPE-PEG(2000)PDP sur surface d’or
2.2. Utilisation d’une molécule facilitant la fusion lipidique : l’alpha peptide
2.3. Incorporation de l’Aquaporine Z
2.4. Optimisation du ratio molaire de la tBLM et incorporation d’AqpZ
3. Conclusion
4. Références
Chapitre 3 : Mise au point d’une membrane biomimétique
1. Formation d’une bicouche lipidique supportée (SLB) biomimétique
1.1. Effet de la concentration en calcium sur la formation de SLB composée de lipides totaux extraits d’E.coli
1.2. Recherche des conditions pour former une SLB biomimétique complète
1.3. Effet de la composition lipidique de la SLB sur la production de l’alpha hémolysine-eGFP
2. Formation d’une tBLM biomimétique et son impact sur la production d’Aquaporine Z
2.1. Formation d’une tBLM biomimétique
2.2. Incorporation d’Aquaporine Z
3. Conclusion
4. Références
Chapitre 4 : Etude de la fonctionnalité des protéines membranaires
1. Mesures de conductance: système expérimental
1.1. Le système expérimental
1.2. Formation de la bicouche suivie de l’incorporation de protéines
2. Mesure de la conductance de canaux ioniques : résultats
3. Conclusion
4. Références
CONCLUSION
