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Procédés chromatographiques pour la séparation des protéines
Les procédés chromatographiques sont les techniques séparatives les plus appliquées pour la purification des protéines. Selon le principe physique mis en jeu pour réaliser la séparation, différents types de procédés chromatographiques ont été décrits. Parmi eux la chromatographie d’exclusion stérique, la chromatographie des intéractions hydrophobes, la chromatographie d’affinité et la chromatographie d’échange d’ions sont très largement utilisées pour des milieux biochimiques. La séparation des protéines se base alors sur la taille, le caractère hydrophobe, l’affinité pour un ligand et la charge des biomolécules du mélange .
La chromatographie est par définition un procédé discontinu, qui se réalise en trois étapes au minimum, avec des phases de lavage intermédiaires : la charge, qui correspond à la mise en contact du support chromatographique avec la solution contenant le soluté à séparer ; l’élution, ou phase permettant de récupérer à nouveau les solutés chargés dans le support chromatographique dans une solution dite d’élution; et, l’équilibration qui est l’étape qui permet de préparer le support chromatographique pour une nouvelle utilisation.
La mise en œuvre d’un procédé chromatographique se fait normalement en colonne, le mode de contact le plus utilisé étant le lit fixe. En effet, ce mode de contact est celui qui permet de travailler aux plus grands débits avec les meilleures résolutions possibles. Néanmoins, d’autres modes de fonctionnement, dont le lit fluidisé, le lit mobile et plus récemment le lit expansé, sont possibles bien que leur utilisation reste très marginale.
Quel que soit le type de procédé mis en œuvre et le mode de contact, le support solide utilisé pour la séparation est sans doute au cœur des procédés chromatographiques, en particulier dans les applications industrielles. Un grand nombre de procédés ont été développés, étudiés et mis en œuvre industriellement. La littérature est aussi sur ce point particulièrement riche car leur développement est, et, a été, très important. Après une très brève introduction sur les différents types des procédés chromatographiques, cette première partie de l’étude bibliographique s’attache à présenter les supports chromatographiques. En effet, la connaissance approfondie de ces matériaux de plus en plus complexes est essentielle pour la compréhension des mécanismes dont ils sont le siège.
Les différents procédés chromatographiques
La chromatographie d’exclusion stérique
La chromatographie d’exclusion stérique ou « de taille » est basée sur la séparation des protéines par tamisage moléculaire. En effet, la différence de taille des molécules à séparer est exploitée en utilisant des supports chromatographiques de type gel, dont on ajuste la taille des pores afin de permettre aux protéines en dessous d’une certaine taille critique de se déplacer à travers le gel à une vitesse proportionnelle à leur masse moléculaire. La chromatographie d’exclusion stérique est une technique largement utilisée mais elle présente une faible sélectivité et elle est généralement limitée à être une étape intermédiaire ou de finition dans les procédures de purification. Elle est très souvent suivie d’une étape de concentration des protéines (Tsonev et Hirsh, 2008).
La chromatographie d’interactions hydrophobes
L’application de la chromatographie d’interactions hydrophobes aux protéines chargées, exploite l’interaction réversible de la protéine avec la surface hydrophobe d’une phase stationnaire en contact avec une phase mobile de force ionique élevée. La protéine est libérée par diminution de la force ionique de l’éluant. La chromatographie d’interactions hydrophobes est un choix privilégié pour le fractionnement des protéines après les étapes de précipitation au sulfate d’ammonium (Tsonev et Hirsh, 2008).
La chromatographie d’affinité
La chromatographie d’affinité repose sur une interaction hautement spécifique entre une protéine et un ligand immobilisé sur la surface d’une résine. La protéine est libérée de la phase stationnaire par augmentation de la force ionique de l’éluant, ce qui réduit la force de la liaison. Cette technique est très utile comme une première étape de concentration, car elle permet de façon très sélective la purification d’une protéine à partir d’un milieu biochimique ou biologique complexe. Ses inconvénients sont l’élution des protéines liées de manière non spécifique et l’élution possible des ligands qui peut avoir lieu dans la fraction de la protéine purifiée (Tsonev et Hirsh, 2008).
La chromatographie d’échange d’ions (CEI)
La séparation par chromatographie d’échange d’ions se base sur la différence de charge électrique des protéines. En effet, lors de l’échange d’ions, les espèces d’une certaine charge contenues dans une solution sont séparées de celle-ci par fixation sur un matériau solide (l’échangeur d’ions), dans lequel elles remplacent une quantité équivalente d’ions de même charge. Les ions de charge opposée ne sont pas affectés (Zeitoun, 2011; Rathore et Pinky, 2012) .
Dans le cas de la séparation des protéines, la chromatographie d’échange d’ions est généralement effectuée en ajustant d’abord le pH de la solution à une valeur bien définie de telle sorte que les protéines d’intérêt se trouvent électriquement chargées en adéquation avec la nature de l’échangeur. Une fois retenues, les protéines sont éluées de l’échangeur par augmentation de la force ionique (le plus fréquemment). Du strict point de vue de l’échange d’ions, les protéines se comportent comme des ions de valence multiple. Bosma et Wesselingh (1998) ont supposé que la charge effective de la protéine se trouve à sa surface et que le reste de sa charge totale se trouve au centre de la protéine.
Initialement, les ions du sel sont adsorbés et la protéine est infiniment loin de la surface de l’échangeur. Les contre-ions liés à la protéine se déplacent ensuite vers les ions du sel provenant de l’échangeur d’ions ce qui permet à la protéine de se fixer à l’échangeur d’ions. Il y a donc une stœchiométrie pour l’échange d’ions : une charge sortante de l’échangeur doit être remplacée par une charge identique provenant de la solution afin de préserver l’électroneutralité dans l’échangeur et dans la solution. La nature stœchiométrique du procédé chromatographique d’échange d’ions fait la différence avec le procédé d’adsorption proprement dit (Zagorodni, 2007).
Les principaux avantages de la chromatographie d’échange d’ions sont (i) un principe de séparation assez simple et facile à mettre en œuvre, (ii) une grande capacité d’adsorption, (iii) une résolution de séparation qui peut être élevée. Son principal inconvénient est la difficulté à séparer des protéines ayant le même nombre de charges effectives, qui seront alors, en théorie, éluées simultanément. Cela limite alors considérablement la sélectivité de la chromatographie d’échange d’ions lorsque des mélanges complexes de protéines doivent être séparés (Tsonev et Hirsh, 2008).
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
I. Procédés chromatographiques pour la séparation des protéines
I.1. Les différents procédés chromatographiques
I.1.1. La chromatographie d’exclusion stérique
I.1.2. La chromatographie d’interactions hydrophobes
I.1.3. La chromatographie d’affinité
I.1.4. La chromatographie d’échange d’ions (CEI)
I.2. Les résines chromatographiques échangeuses d’ions
I.2.1. Classification selon les groupements fonctionnels
I.2.2. Classification selon la matrice chromatographique
a) Les polysaccharides réticulés homogènes
b) Les polymères macroporeux à base de polymères synthétiques
c) Les matrices tentaculaires
d) Les matériaux composites basés sur le concept de « gel in shell »
I.3. Propriétés intrinsèques des résines chromatographiques d’échange d’ions
I.3.1. Capacité d’échange d’ions
I.3.2. Distance entre les groupements fonctionnels et leur densité
I.3.3. Taille des particules
I.3.4. Structure interne des échangeurs : porosité, tortuosité et taille des pores
I.4. Conclusion
II. Les protéines : Structure et propriétés intrinsèques
II.1. Structure des protéines
II.2. Les propriétés intrinsèques des protéines
II.2.1. Charge
II.2.2. Distribution des charges
II.2.3. Hydrophobicité / hydrophilie des protéines
II.2.4. Activité de surface des protéines et modifications conformationnelles
II.2.5. Poids moléculaire
II.2.6. Diffusivités effective et moléculaire des protéines
II.3. Conclusion
III. Interactions mises en jeu et facteurs influençant la rétention de protéines en chromatographie d’échange d’ions
III.1. Interactions électrostatiques
III.2. Interactions hydrophobes
III.3. Comportement des protéines à l’état adsorbé
III.3.1. Adsorption et changements conformationnels des protéines
III.3.2. Adsorption et orientation des protéines
III.3.3. Interactions latérales
III.3.4. Adsorption multicouches, réversibilité et désorption
III.4. Interactions mises en jeu dans les systèmes multi-solutés
III.5. Facteurs physico-chimiques influençant les interactions dans le procédé d’échange d’ions
III.5.1. pH
III.5.2. Température
III.5.3. Force ionique
III.5.4. Concentration initiale des protéines
III.6. Conclusion
IV. Equilibre d’échange d‘ions
IV.1. Les modèles d’équilibre d’échange d’ions
IV.1.1. Modèle de Langmuir
a) Isothermes non compétitives
b) Isothermes compétitives (Bellot, 1994)
c) Conclusion
IV.1.2. Loi d’action de masse
a) Isotherme non compétitive
b) Isothermes compétitives
c) Conclusion
V. Transfert de matière dans les résines échangeuses d’ions
V.1. Le transfert externe ou diffusion dans le film
V.2. Le transfert interne ou diffusion intra-particulaire
V.2.1. Modèle de diffusion dans les pores
V.2.2. Modèle de diffusion superficielle
V.3. Identification des mécanismes cinétiques
V.3.1. Bilan de matière dans le réacteur fermé
V.3.2. Résolution des bilans de matière : cas limites
V.4. Conclusion
CONCLUSION GENERALE
