Sources de biomasse lignocellulosique

Table des matières

INTRODUCTION GÉNÉRALE
CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1 De la biomasse lignocellulosique au bioéthanol
1.1 Structure et composition de la lignocellulose
1.1.1 Organisation de la paroi végétale
1.1.2 La cellulose
1.1.3 Les hémicelluloses
1.1.4 Les pectines
1.1.5 Les lignines
1.2 Utilisation de biomasse lignocellulosique pour la bioraffinerie
1.2.1 Sources de biomasse lignocellulosique
1.2.2 Concept de la bioraffinerie lignocellulosique
1.3 Procédés de production de bioéthanol
2 Enzymes impliquées dans la dégradation des polysaccharides
2.1 Principes de la classification CAZy
2.2 Les cellulases
2.3 Les hémicellulases
2.4 Les LPMO
2.4.1 Découverte de leur activité
2.4.2 Classification actuelle
2.4.3 Structure tridimensionnelle des LPMO
2.4.4 Mécanismes proposés
2.4.5 Partenaires redox
2.4.6 Utilisation des LPMO dans les cocktails cellulolytiques
3 Utilisation de sécrétomes fongiques pour l’hydrolyse de biomasse lignocellulosique 
3.1 Classifications et modes de vie des champignons
3.2 Utilisation du sécrétome de Trichoderma reesei
3.2.1 Système cellulolytique de Trichoderma reesei
3.2.2 Etudes transcriptomiques et protéomiques
3.2.3 Ingénierie génétique des souches
3.2.4 Amélioration des enzymes
3.2.5 Mise en œuvre de l’hydrolyse enzymatique
3.3 Stratégies de supplémentation
3.3.1 Limitations du sécrétome de T. reesei
3.3.2 La biodiversité fongique comme source d’inspiration
3.3.3 Supplémentation par des sécrétomes fongiques
4 Enjeux et stratégie du projet de recherche
CHAPITRE II : MATÉRIEL ET MÉTHODES
1 Préparation des sécrétomes
1.1 Souches fongiques
1.2 Milieux de culture
1.3 Culture et récolte des sécrétomes
2 Tests de saccharification en supplémentation
2.1 Substrats utilisés
2.2 Cocktail enzymatique de référence
2.3 Tests de saccharification en tubes
2.4 Tests de saccharification en microplaques
2.5 Quantification des produits et calcul des rendements
3 Analyse du contenu protéique des sécrétomes
3.1 Identification des protéines par LC-MS/MS
3.2 Analyse des données
4 Analyse bioinformatique 
5 Production de protéines recombinantes
5.1 Construction et transformation des vecteurs d’expression
5.2 Production des protéines
5.2.1 Milieux de culture
5.2.2 Production en plaques Deepwell
5.2.3 Production en fioles
5.2.4 Production en bioréacteurs
5.3 Purification des protéines
5.3.1 Purification par chromatographie d’affinité
5.3.2 Purification par chromatographie d’échange d’anions
5.4 Caractérisation biochimique des protéines produites
5.4.1 Analyse ICP-MS
5.4.2 Séquençage N-terminal
5.4.3 Analyse de masse globale
5.4.4 Tests Amplex Red
6 Caractérisation de l’activité des LPMO
6.1 Substrats utilisés
6.2 Tests de dégradation de substrats
6.3 Tests de synergies sur cellulose
6.4 Analyse des produits solubles de dégradation
6.4.1 HPAEC-PAD
6.4.2 Spectrométrie de masse
6.5 Spectroscopie du site actif
6.6 Modélisation des structures 3D par homologie
CHAPITRE III : IDENTIFICATION D’UNE NOUVELLE FAMILLE DE LPMO DANS DES SÉCRÉTOMES FONGIQUES
1 Résumé
2 Background
3 Results
3.1 Exploration of fungal secretomes to improve biomass saccharification
3.2 Comparative proteomic analysis of fungal secretomes
3.3 Bioinformatic analysis of a new LPMO family
3.4 Heterologous expression and purification
3.5 Substrate specificity and regioselectivity of cleavage
3.6 Synergy assays
4 Discussion
5 Conclusions
CHAPITRE IV : CARACTÉRISATION DE TROIS NOUVELLES LPMO DE LA FAMILLE AA16
1 Résumé
2 Background 
3 Results and discussion
3.1 Selection and production of three novel AA16 enzymes
3.2 Activity of AA16 enzymes on cellulose
3.3 Redox partners
3.4 Synergy assays
3.5 Spectroscopic analysis of the active site
3.6 Structural data
4 Conclusions
CHAPITRE V : DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSIONS
1 Discussion générale 
1.1 Exploration des sécrétomes et choix des cibles enzymatiques
1.2 Production et purification des LPMO AA16
1.3 Particularités de l’activité des AA16
2 Conclusions et perspectives 
ANNEXES