Méthodes de caractérisation de protéines affines pour les nouvelles bases épigénétiques dérivées de la 5mC

Table des matières

Introduction
1 Modifications épigénétiques de l’ADN
Epigénétique : définition
Méthylation de l’ADN
1.2.1 Méthylation de novo par les DNMT3
1.2.2 Maintien de la méthylation par la DNMT1
1.2.2.1 Une première proposition de mécanisme de maintenance
1.2.2.2 Maintien de la méthylation de l’ADN : nouveau modèle.
1.2.2.3 UHRF1 : un acteur épigénétique majeur
Régulation de la méthylation de l’ADN
1.3.1 La déméthylation passive de l’ADN
1.3.2 La déméthylation active de l’ADN : les premières hypothèses.
1.3.2.1 La déméthylation enzymatique
1.3.2.2 Les mécanismes de réparation de l’ADN
Les nouveaux acteurs de l’épigénétique et leurs rôles dans la régulation de la méthylation
1.4.1 L’oxydation des 5mC comme étape cruciale de la déméthylation
1.4.1.1 Les enzymes TET et l’oxydation de la 5mC
1.4.1.2 La famille enzymatique TET
1.4.1.3 Réaction catalysée par les enzymes TET
1.4.1.4 Substrats des enzymes TET : nouvelles bases épigénétiques
1.4.2 Le rôle des bases oxydées dans la déméthylation de l’ADN.
1.4.2.1 La dilution passive des bases oxydées (AM-PD)
1.4.2.2 Une élimination enzymatique directe des bases oxydées
1.4.2.3 Réparation des bases oxydées par le BER (AM-AR)
Bilan des mécanismes généraux de la méthylation de l’ADN
2 Méthodes de caractérisation de protéines affines pour les nouvelles bases épigénétiques dérivées de la 5mC
EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) ou gel retard
2.1.1 Principe général de l’EMSA
2.1.2 Application de l’EMSA
L’analyse protéomique pour la caractérisation de protéines partenaires
2.2.1 Le « pull-down » ou la purification d’affinité : principe
2.2.2 Le « pull-down » ou la purification d’affinité : applications
2.2.2.1 Stratégie « Label-free »
2.2.2.2 Stratégie avec marquage
Bilan des études de protéomiques permettant l’identification des protéines
partenaires des dérivées oxydés de la 5mC
3 Méthodes de pontage entre deux partenaires d’interaction
Le Formaldéhyde : un agent de pontage chimique
Les agents de pontage photo-chimiques
3.2.1 L’ADN comme agent de photomarquage
3.2.2 Les agents de photomarquage classiques
3.2.2.1 Les azotures d’aryle
3.2.2.2 Les diazirines
3.2.2.3 La benzophénone
3.2.3 Les agents de photomarquage analogues de nucléobases
3.2.3.1 Les dérivés halogénés
3.2.3.2 Les dérivés de nucléobases thiolés
Incorporation des agents photoactivables dans des sondes oligonucléotidiques.
3.3.1 La synthèse enzymatique
3.3.2 La synthèse chimique
3.3.2.1 Stratégie de fonctionnalisation pré-synthétique
3.3.2.2 Stratégie de fonctionnalisation post-synthétique
Le PAL (photoaffinity labeling) couplé à la spectrométrie de masse.
Projet de thèse
Partie résultats
4 Conception et évaluation de différentes sondes oligonucléotidiques photoactivables et mise au point des conditions de photomarquage
Synthèse de sondes ODN photoactivables
4.1.1 Conception des sondes
4.1.2 Synthèse des séquences oligonucléotidiques modifiées
4.1.2.1 La synthèse d’oligonucléotides sur support solide
4.1.2.2 Incorporation des agents photoactivables benzophénone et diazirine
4.1.3 Récapitulatif des oligonucléotides utilisés
Comparaison et évaluation des sondes ODN photoactivables simple brin
4.2.1 La hRPA comme protéine modèle pour les sondes ADN simple brin
4.2.1.1 Evaluation de l’affinité de hRPA pour les différents ODN par EMSA
4.2.1.2 Évaluation de l’efficacité de photomarquage des différents ODN avec hRPA
4.2.1.3 Identification de hRPA dans les complexes covalents formés par spectrométrie de masse
4.2.2 Évaluation de l’efficacité de photomarquage des différentes sondes ODN dans un mélange protéique
4.2.2.1 Identification de hRPA dans les complexes covalents formés
4.2.3 Photomarquage avec la sonde ODN-4 ST dans un extrait cellulaire eucaryote
4.2.3.1 Identification de hRPA dans les complexes covalents formés
4.2.3.2 Détermination du caractère sélectif de nos sondes modifiées simple brin
Conclusion