METHODES D’ANALYSES DES EXOPOLYSACCHARIDES

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE 1. ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
I.LES EXOPOLYSACCHARIDES D’ORIGINE MICROBIENNE
1.Définition
2.Les microorganismes producteurs des exopolysaccharides
3.Les exopolysaccharides des bactéries lactiques
4.Composition chimique et structure des exopolysaccharides des bactéries lactiques
5.Classification des exopolysaccharides
5.1.Les homopolysaccharides
5.2.Les hétéropolysaccharides
6.La biosynthèse des EPS
6.1.Les enzymes de biosynthèse
6.2.Voie de synthèse extracellulaire des exopolysaccharides
7.Applications industrielles des exopolysaccharides microbiens
7.1.Intérêt et utilisation des exopolysaccharides
7.1.1. Les propriétés fonctionnelles des polysaccharides
7.2.Applications industrielles
7.2.1. Domaine agroalimentaire
7.2.2. Domaine médical
7.2.3. Domaine thérapeutique et santé
II.LE DEXTRANE
1.La découverte du dextrane
2.Définition et structure du dextrane
3.Les bactéries productrices
3.1.Le genre Leuconostoc
3.1.1.Définition et caractères bactériologiques
3.1.2.Habitat des Leuconostocs
4.La biosynthèse du dextrane
5.Milieux de culture utilisés
6.Applications et utilisations du dextrane
6.1.En agroalimentaire
6.2.En biomédicale
III.METHODES D’ANALYSES DES EXOPOLYSACCHARIDES
1.Méthodes de détection et de screening des EPS
1.1.Examen visuel
1.2.Les colorations
2.Extraction et purification des EPS
3.Dosage colorimétrique des EPS purifiés
4.Etude de la viscosité
5.Méthodes de caractérisation et analyses des exopolysaccharides
5.1.Caractérisation des EPS à l’échelle chromatographique
5.2.Détermination structurale des exopolysaccharides
5.2.1.Analyse par infrarouge
5.2.2.Analyses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
TAXONOMIE MOLECULAIRE ET IDENTIFICATION BACTERIENNE
1.Microbiologie « classique »
2.Apport de la biologie moléculaire
2.1.Identification bactérienne par l’amplification de l’ADNr 16S
2.1.1.Amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaine)
2.1.2.Le choix de l’ADNr 16S
2.2.Séquençage de l’ADNr 16S
2.3.Analyse phylogénétique des séquences
2.4.Identification bactérienne avec des amorces spécifiques (amplification génique)
3.Taxonomie moléculaire et classification du genre Leuconostoc
3.1.Classification du genre Leuconostoc
3.2.Diagnostic moléculaire des Leuconostocs par amplification génique
3.3.L’analyse phylogénétique des différentes espèces de Leuconostoc
3.4.Gène d’intérêt de la glycosyltransférase (GTF) chez les Leuconostoc
CHAPITRE II. MATERIELS ET METHODES
I.Isolement des souches bactériennes productrices des Exopolysaccharides
1.Échantillonnage et conditions de croissance
1.1.Échantillonnage d’origine animalier et végétal
1.2.Isolement et purification des souches
2.Caractérisation phénotypique des isolats
2.1.Examen macroscopique
2.2.Examen microscopique
2.3.Test de la catalase
2.4.Croissance à différentes températures
2.5La tolérance à la salinité
3.Criblage des souches productrices d’exopolysaccharides
II.IDENTIFICATION MOLECULAIRE DES SOUCHES ISOLEES
1.Extraction de l’ADN génomique des souches bactériennes sélectionnées
1.1.Extraction d’ADN génomique par la méthode conventionnelle
1.2.Extraction d’ADN par la méthode de boiling
1.3.Dosage et évaluation de la pureté de l’ADN
1.4.Vérification qualitatif de l’ADN extrait
2.PCR spécifique au genre Leuconostoc sp
3.Amplification du gène d’ADNr 16S
4.Electrophorèse sur gel d’agarose
5.Séquençage des produits de la PCR
6.Traitement et analyse phylogénétique des séquences
6.1Nettoyage et assemblage des séquences
6.2.L’alignement et analyse bio-informatique des séquences d’ADN
6.3.Analyse phylogénétique
7.Recherche du gène Glucosyltransferase (GTF)
III.CARACTERISATION DES EXOPOLYSACCHARIDES PRODUITS
1.Production des EPS
2.Extraction des EPS
3.Lyophilisation des EPS
4.Dosages des sucres totaux
5.Détermination de la viscosité apparente
6.Caractérisation chimique et structurale des EPS
6.1.Analyse de la composition des EPS
6.1.1.Hydrolyse des EPS
6.1.2.Chromatographie sur couche mine
6.2.Analyse de la structure des EPS
6.2.1.Analyse des EPS par spectroscopie infrarouge (IR)
6.2.2.Analyse par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)
CHAPITRE III. RESULTATS ET DISCUSSION
I.ISOLEMENT DES SOUCHES BACTERIENNES PRODUCTRICES DES EPS
1.Caractérisation phénotypique des isolats
2.Criblage des souches potentiellement productrices des EPS
II.IDENTIFICATION MOLECULAIRE DES SOUCHES
1.PCR spécifique au genre Leuconostoc sp
2.Amplification de l’ADNr 16S
3.Traitement et analyse phylogénétique des séquences
3.1.Traitement et nettoyage des séquences
3.2.Analyse des séquences par le Blast
3.3.Elaboration des arbres phylogéniques
4.Recherche du gène impliqué dans la biosynthèse du dextrane
III.CARACTERISATION DES EXOPOLYSACCHARIDES PRODUITS
1.Production des EPS
2.Extraction et lyophilisation des exopolysaccharides
3.Dosage des sucres totaux
4.Détermination de la viscosité apparente
5.Caractérisation structurale des EPS
5.1.Chromatographie sur couche mince
5.2.Résultats des analyses par spectroscopie infrarouge des EPS
5.2.Résultats des analyses par spectroscopie infrarouge des EPS
5.3.Analyse des EPS par RMN
5.3.1.Résultats d’analyse par RMN H1
5.3.2.Résultats d’analyse des EPS par RMN C
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE