L’hypothèse de la cascade amyloïde

Table des matières

1.Introduction
1.1 La maladie d’Alzheimer
1.1.1 La forme sporadique de la maladie d’Alzheimer
1.1.2 La forme familiale de la maladie d’Alzheimer
1.1.3 Les traitements de la maladie d’Alzheimer
1.2 Caractéristiques cellulaires et moléculaires
1.2.1 L’hypothèse de la cascade amyloïde
1.2.2 L’effet pathologique des peptides Aβ
1.3 Les secrétases
1.3.1 Les secrétases responsables du clivage primaire de l’APP
1.3.2 La γ-secrétase responsable du clivage secondaire de l’APP
1.4 La préséniline
1.4.1 Propriétés moléculaires
1.4.2 La mutation PS1Δ9
1.4.3 Les rôles de PS1 indépendants de la voie amyloïde
1.4.3.1 PS1 et la voie de signalisation Notch
1.4.3.2 PS1 et les voies de signalisations tyrosine kinase dépendantes
1.4.3.3 PS1 interagit avec les protéines de la famille Armadillo
1.5 Hypothèse et objectifs de recherche
2 Matériel et méthodes
2.1 Préalables au criblage par double hybride en levure
2.1.1 Le système « split-ubiquitin »
2.1.2 Les levures Saccharomyces cerevisiae
2.1.3 Liste des plasmides du système « split-ubiquitin »
2.1.3.1 « Appât » pBT3-N PS1-Cub-LexA-VP16
2.1.3.2 « Proie » pPR3-N-NubG-X
2.1.3.3 pNubG-Fe65, pTSU2-APP et pOst1-Nub
2.1.4 Construction du vecteur pBT3-N PS1-Cub-LexA-VP16
2.1.4.1 Extraction de l’ADNp pBT3-N de bactéries DH5α
2.1.4.2 Obtention des inserts PS1 WT et Δ9 par PCR 30
2.1.4.3 Digestion du vecteur pBT3-N et des inserts PS1 :
2.1.4.4 Ligation des inserts PS1 dans le vecteur pBT3-N :
2.1.4.5 Transformation des bactéries DH5α
2.2 Criblage par double hybride en levure
2.2.1 Transformations des levures CD3-808 « MAT a » et CD3-809 « MAT α »
2.2.2 Essai fonctionnel du système « split-ubiquitin »
2.2.3 Criblage par accouplement des CD3-808 et CD3-809
2.2.3.1 Criblage pilote
2.2.3.2 Criblage de la banque d’ADNc extraits de cerveau humain
2.2.4 Analyse des clones positifs obtenus
2.2.4.1 Isolation des plasmides de levure
2.2.4.2 Identification des gènes candidats
2.2.4.3 Confirmation des interactions protéiques par double hybride en levure
2.3 Confirmation des interactions protéiques en cellules
2.3.1 Les HEK 293T
2.3.2 Liste des plasmides utilisés en cellule
2.3.2.1 pEGFP
2.3.2.2 pcDNA3 et pcDNA3.1-His C
2.3.2.3 pCMV-Zéo-HA PS1
2.3.3 Transfection des cellules
2.3.4 Lyse cellulaire et extraction protéique
2.3.5 Co-Immunoprécipitation
2.3.6 Immunodétection protéique par Western Blot
2.3.6.1 Électrophorèse sur gel polyacrylamide et transfert sur membrane PVDF
2.3.6.2 Immunodétection
3 Résultats
3.1 Essai fonctionnel du système « split-ubiquitin » en levure
3.2 Criblage utilisant l’appât PS1 WT-Cub-TF
3.2.1 L’appât pBT3-N PS1 WT-Cub-TF est fonctionnel
3.2.2 La fusion des levures CD3 808 « Mat a » contenant l’appât PS1 WT-Cub-TF est efficace
3.2.3 Criblage de la banque d’ADNc extraits de cerveau humain
3.2.4 Identification des plasmides candidats
3.2.5 Confirmation des interactions protéiques en levure
3.3 Criblage utilisant l’appât PS1Δ9-Cub-TF
3.3.1 Essai fonctionnel
3.3.2 Évaluation de la fusion des levures CD3 808 « Mat a » contenant l’appât PS1Δ9-Cub-TF
3.3.3 Criblage de la banque d’ADNc extraits de cerveau humain
3.3.4 Identification des plasmides candidats
3.3.5 Confirmation des interactions protéiques en levure
3.4 Étude de PS1 WT, PS1Δ9 et des protéines candidates en cellule HEK 293T
4 Discussion
4.1 Comparaison des interactions protéiques de PS1 WT et PS1Δ9
4.2 PS1 interviendrait dans les processus de réparation de l’ADN
4.3 PS1 permettrait le maintient du cycle cellulaire neuronal
4.4 PS1 participerait à une nouvelle voie de signalisation liée aux RTK
4.5 PS1 permettrait la stabilisation de l’activité transcriptionnelle ribosomale
4.6 PS1 participerait à l’inhibition de la PRPS
4.7 PS1 pourrait jouer un rôle dans l’homéostasie énergétique des astrocytes
Conclusions et perspectives
Bibliographie