Table des matières
Introduction
I. Détection des gaz diatomiques par les protéines senseurs à base d’hème
1.1. L’hème et le fer
1.2. Les gaz diatomiques
a) Le dioxygène (O₂)
b) Le monoxyde d’azote (NO)
c) Le monoxyde de carbone (CO)
1.3. Les senseurs à gaz à base d’hème
1.3.1. Les hémo-senseurs d’O₂
1.3.2. Les hémo-senseurs de NO
1.3.3. Les hémo-senseurs à CO
a) Les senseurs à CO chez les eucaryotes
b) Les senseurs à CO chez les bactéries
b.1) CooA, senseur à CO anaérobie
b.2) RcoM, senseur à CO aérobie
1.4. Les mycobactéries
1.4.1. Généralités et caractéristiques
1.4.2. Mycobacterium tuberculosis (Mtb)
1.4.3. Mécanismes de défense de l’hôte
1.4.4. Mécanismes de détection des gaz chez Mycobacterium tuberculosis
a) Système de régulation DosRS-DosT
b) Senseurs kinases DosS/DosT
c) Le système MprA/B
d) Le régulateur de transcription Rv0081
e) Détection et réponse au CO dans Mtb ; autres mécanismes
e.1) Le gène cor (carbone monoxide resistance)
e.2) Cluster de gènes impliquant cor (rv1829)
e.3) Le régulateur de transcription Rv1828
1.5. Problématique et objectifs de la thèse
II-Mécanismes de détection et signalisation du CO : l’hémo-senseur RcoM-2
2.1. Introduction
2.2. Caractérisation de RcoM-2
2.2.1. Clonage, expression et purification de RcoM-2
2.2.2. Analyses de RcoM-2 par spectroscopie d’absorption à l’équilibre
2.2.3. Cinétique de liaison du ligand CO
2.2.4. Dissociation du ligand CO
2.2.5. Dynamique de l’interaction hème-CO : recombinaison géminée du CO
2.2.6. Liaison de RcoM-2 à l’ADN
III-Mécanismes de détection du CO chez les mycobactéries
3.1 Introduction
3.2. Caractérisation de la protéine Cor
3.2.1. Caractérisation biochimique de Cor
a) Surexpression inductible de Cor
b) Cor est un dimère très stable
c) Modélisation de la protéine Cor
3.2.2. Caractérisation spectroscopique de Cor
a) Liaison Cor-hème
b) Cor fixe du CO et lie de l’hème de façon spécifique
c) La présence du CO accélère la liaison de l’hème à Cor
d) Dynamique du ligand diatomique CO
e) Recombinaison du ligand hémique
3.2.3. Études des mutants Cor-H58A et Cor-H70A
a) Expression et purification de Cor-H58A et Cor-H70A
b) Caractérisation spectroscopique des mutants
b.1) Liaison d’hème dans les mutants en absence du CO
b.2) Liaison d’hème en présence du CO
3.3. Le cluster de gènes « cor »
3.3.1. Alignements et analyses in silico
3.3.2. Expression et purification des régulateurs de transcription
a) Le régulateur de transcription Rv0081
b) Le régulateur de transcription Rv1828
3.3.3. Interaction protéines-ADN
3.3.3.1) Spectroscopie d’anisotropie de fluorescence
a) Principe de l’anisotropie de fluorescence
b) Fixation de Rv0081 et Rv1828 à la région régulatrice prédite de cor
c) Mesures de fixation de Rv1828 avec la région promotrice rv0081
d) Cor lie de l’ADN en présence d’hème et du CO
d.1) Etude de la liaison de Cor à la région ADN rv1831/rv1832
d.2) Etude des mutant de Cor-H58A et Cor-H70A
3.3.3.2) Electrophoretic mobility shift assay : EMSA
a) Principe de l’EMSA (« retard sur gel »)
b) EMSA avec Rv0081, Rv1828 et Cor
3.4. Cristallogenèse des protéines
3.5. Rôle physiologique de Cor
3.5.1. Croissance mycobactérienne en présence du CO
a) Souche sauvage de M. smegmatis
b) Création d’une souche de délétion de cor
IV-Conclusions et perspectives
V-Matériels et méthodes
5.1. Techniques de biologie moléculaire
5.1.1. Milieux de culture et croissance bactérienne
5.1.2. Cartes des plasmides et gènes utilisés
5.1.3. Souches des bactéries utilisées
5.1.4. Extraction de l’ADN génomique de M. smegmatis
5.1.5. Amplification et clonage du gène cor (rv1829)
5.1.6. Transformation bactérienne
5.1.7. Extraction, purification de l’ADN plasmidique et digestion enzymatique
5.1.8. Vérification des génotypages (constructions plasmidiques)
5.1.9. Mutagenèse dirigée
5.1.10. Listes des amorces utilisées
5.2. Manipulation des protéines et études biochimiques
5.2.1. Expression des protéines dans Escherichia coli
5.2.2. Purification des protéines et détermination de la concentration
5.2.3. Analyses des protéines purifiées par SDS-PAGE
5.2.4. Technique d’EMSA
5.3. Approches spectroscopiques
5.3.1. Spectroscopie d’absorption
5.3.2. Anisotropie de fluorescence
5.3.3. Absorption résolue en temps
5.4. Microscopie confocale
5.5. Ultracentrifugation analytique de la protéine Cor
5.6. Cristallisation des protéines
5.7. Modélisation moléculaire de Cor
VI-Références bibliographiques
VII-Annexes
