Le marquage ADN

Table des matières

INTRODUCTION
1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 
1.1. Les cellules souches mésenchymateuses – intérêt en médecine régénérative
1.1.1. Définition d’une cellule souche mésenchymateuse
1.1.2. Etendue de la recherche actuelle sur les CSM
1.1.3. Les cellules souches mésenchymateuses d’origine adipeuse
1.2. Mécanisme d’action des ASC : données actuelles
1.2.1. Propriété de régénération des ASC
1.2.2. Propriétés paracrines et immuno-modulatrices des ASC
1.2.3. Administration et biodistribution des ASC
1.2.3.1. Les différentes voies d’administration
1.2.3.2. Le « homing » ou guidage des ASC vers le tissu lésé
1.2.3.3. Notion de niche cellulaire
1.3. Le « tracking » des cellules souches – méthodes actuelles
1.3.1. Marquage en temps réel – non invasif
1.3.1.1. Marquage direct
1.3.1.2. Marquage indirect
1.3.2. Marquage post-mortem
1.3.2.1. Immunohistochimie
1.3.2.2. Hybridation in-situ
1.3.2.3. PCR quantitative
1.3.3. Bilan sur les techniques de marquage
1.4. Sondes dirigées vers les chromosomes sexuels
1.5. Choix du modèle animal
2. PARTIE EXPERIMENTALE
2.1. MATERIELS ET METHODES
2.1.1. Objectif de notre étude
2.1.2. La culture cellulaire
2.1.2.1. Culture à partir de tissu cutané
2.1.2.1.1. Mise en
culture des morceaux de peau
2.1.2.1.2. Division
2.1.2.1.3. Récupération des cellules en division
2.1.2.1.4. Fixation
2.1.2.1.5. Etalement des cellules sur lamelles
2.1.2.2. Culture à partir de sang
2.1.2.2.1. Prélèvement et mise en culture
2.1.2.2.2. Arrêt des cultures et fixation
2.1.2.2.3. Etalement des cellules sur lamelles
2.1.3. Microdissection
2.1.3.1. Préparation des lamelles
2.1.3.2. Matériel pour microdissection
2.1.3.3. Procédure de microdissection
2.1.4. Première amplification par PCR
2.1.4.1. Pré-amplification
2.1.4.2. Amplification
2.1.5. Réalisation des sondes
2.1.5.1. Marquage ADN (kit BioPrime®)
2.1.5.2. Précipitation des sondes
2.1.5.3. Préparation des sondes
2.1.6. Protocole d’hybridation in-situ adapté aux lames cytologiques
2.1.6.1. Préparation des lames cytologiques
2.1.6.2. Hybridation
2.1.6.2.1. Hybridation avec l’Hybridizer ® DAKO
2.1.6.2.2. Hybridation avec pré-étapes de dénaturation
2.1.6.3. Lavages stringents
2.1.6.4. Préparation des anticorps et révélation
2.1.7. Protocole d’hybridation in-situ adapté aux coupes histologiques
2.1.7.1. Préparation des lames
2.1.7.1.1. Réalisation des lames
2.1.7.1.2. Déparaffinage et réhydratation
2.1.7.1.3. Etapes de prétraitement
2.1.7.2. Hybridation
2.1.7.2.1. Avec pré-étapes de dénaturation
2.1.7.2.2. Avec l’Hybridizer DAKO
2.1.7.3. Lavage
2.1.7.4. Préparation des anticorps et révélation
2.2. RESULTATS
2.2.1. Réalisation des sondes
2.2.2. Test des sondes sur mélanges de cellules mâles et femelles
2.2.3. Test des sondes sur coupes histologiques
2.3. DISCUSSION
3. CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE (logiciel ZOTERO) ANNEXES