Le gène de la dystrophie

Table des matières

Introduction
1. La dystrophie musculaire de Duchenne 
1.1. Historique
1.2. Aspects cliniques et évolution de la maladie de Duchenne
1.3. Génétique de la dystrophie de Duchenne
1.4. La souris mdx et les modèles animaux de la DMD
2. Le muscle squelettique 
2.1. Structure du muscle squelettique
2.2. Régénération musculaire
2.3. Les cellules satellites
3. Traitements et stratégies thérapeutiques  
3.1. Thérapie pharmacologique
3.2. Thérapie génique sans transfert de gène : Le saut d’exon
3.3. Thérapie génique et livraison
3.3.1 Les vecteurs viraux
3.3.2 Les vecteurs non viraux
3.4. Thérapie cellulaire et greffe de myoblastes
3.5. Édition du génome
3.5.1 Méganucléase
3.5.2 Nucléases à doigt de Zinc (Zinc Finger Nucleases (ZFN))
3.5.3 Nucléases effectrices de type activateur de transcription (Transcription activator-like effector nucleases (TALENs))
3.5.4 Courtes répétitions palindromiques regroupées et régulièrement espacées (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats, CRISPR) cf Chapitre 4
4. Le système CRISPR/Cas9 et ses dérivés 
4.1. Définition et mécanisme
4.2. Mutation de la Cas9
4.3. Modulation de l’expression des gènes
4.3.1 Répression de gène
4.3.2 Stimulation de gène
4.4. Les effets Hors cibles
5. La laminine
5.1. La lame basale
5.2. Les laminines
5.3. La laminine 111
5.3.1 Structure de la laminine 111
5.3.2 Gène LAMA1
5.3.3 Expression de la chaine a1 de la laminine
5.3.4 Rôles biologiques de la LM111
5.4. Hypothèse et objectifs
6 Increased expression of laminin 1 chain by dCas9-VP160, a potential treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
6.1. Introduction
6.2. Materials and Methods
6.2.1 Expression vector
6.2.2 Construction and oligonucleotides synthesis
6.2.3 Phosphorylation, formation of double-stranded oligonucleotides and ligation
6.2.4 Transformation of competent bacteria
6.2.5 Transfection of Px330 plasmids in C2C12 myoblasts
6.2.6 Transfection of plasmid PAC154 VP160 in murine C2C12 myoblasts and extraction of cells for mRNA and protein analysis
6.2.7 Surveyor enzyme test on PCR products
6.2.8 Sequencing
6.2.9 Plasmid electroporation in Rag/mdx mouse muscles
6.2.10 RT PCR
6.2.11 Immunocytochemistry on C2C12 transfected or not with puro pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression
6.2.12 Detection of LAMA1 by immunohistochemistry
6.2.13 Western Blot
6.3. Results
6.3.1 Testing of gRNAs targeting LAMA1 promoter
6.3.2 gRNAs in combination with dSpCas9-VP160-2A-PURO increased expression of the LAMA1 mRNA
6.3.3 Combinations of 2 or 3 gRNAs and dCas9-VP160 further increased the expression of the LAMA1 mRNA
6.3.4 Combinations of 2gRNAs and dCas9-P300 further increased the expression of the LAMA1 mRNA
6.3.5 Detection of LAMA1 protein by immunocytochemistry
6.3.6 Detection of LAMA1 protein by Western blot
6.3.7 Increase of LAMA1 expression in rag/mdx muscles
6.4. Discussion and conclusion
6.5. Perspectives