Table des matières
INTRODUCTION
1e PARTIE : ESSAI BIBLIOGRAPHIQUE : LES ENJEUX ACTUELS DE LA RECHERCHE EN MEDECINE REGENERATIVE SUR LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES D’ORIGINE ADIPEUSES
CHAPITRE 1. LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES D’ORIGINE ADIPEUSE : INTERETS ET APPLICATIONS EN MEDECINE REGENERATIVE
1.1. Choisir entre éthique et efficacité : des cellules souches embryonnaires ou adultes?
1.2. Les cellules souches mésenchymateuses et leur implication en médecine régénérative
1.2.1. Qu’est-ce qu’une cellule souche mésenchymateuse ?
1.2.2. Etendue de la recherche sur les csm
1.3. Identification des ASC : une étape indispensable dans le processus de compréhension
1.3.1. De la nécessité d’imposer des définitions claires à la communauté des chercheurs
1.3.2. Les ASC dépassent les critères minimum pour l’identification des MSC
1.3.3. Doit-on caractériser différents types d’ASC ?
CHAPITRE 2. PROBLEMATIQUES DE LA RECHERCHE ACTUELLE
2.1. Mécanisme d’action des ASC
2.1.1. L’activité stromale des CSM dépasse leur potentiel de transdifférentiation
2.1.2. L’activité stromale dans la promotion de l’angiogenèse
2.1.3. Immunomodulation et activité anti-inflammatoire
2.1.4. La fusion hétérotypique permet une reprogrammation
2.2. Biodistribution et traces de rémanence à long terme
2.2.1. Ce que les études s’accordent à dire plus ou moins
2.2.2. Facteurs de variation dans les résultats
a. Le modèle pathologique
b. L’injection locale
2.3. Cancer et CSM : risque de tumorigénicité ou potentiel inhibiteur, une question complexe et controversée
2.3.1. Contradictions : des modèles non standardisés et grande variabilité des facteurs de risque
2.3.2. Le potentiel tumoral est multiple
a. Migration des CSM dans le tissu tumoral : reconnaissance d’un milieu lésionnel
b. L’angiogenèse dans la promotion tumorale
c. Cytokines
d. Immunosuppression
e. Transformation spontanée des CSM en cellules malignes
2.3.3. Inhibition tumorale
2.3.4. Inhibition ou croissance tumorale : une question de dose ?
2.3.5. Thérapies anticancéreuses et CSM
CHAPITRE 3. MATERIEL ET METHODES POUR LE TRACKING in vivo DES ASC EN MEDECINE REGENERATIVE
3.1. Tracking cellulaire : des techniques d’étude complémentaires
3.1.1. De la cytotoxicité de certains marqueurs
3.1.2. Des résultats contradictoires
3.1.3. De nombreuses méthodes de tracking à confronter
3.2. La culture cellulaire pour le développement des meilleurs agents thérapeutiques possible
3.3. Les modèles animaux de la recherche en médecine régénérative : un souci pour l’extrapolation à l’homme ?
3.3.1. Les « chimères » ou modèles de xénotransplantation
3.3.2. Une véritable boite à outils pour la recherche
3.3.3. Des avantages et des inconvénients : l’extrapolation à l’homme est-elle raisonnable ?
a. La question de la taille
b. La niche cellulaire
c. Avantages et inconvénients des modèles animaux en recherche pré-clinique de thérapie cellulaire
2e PARTIE : MISE AU POINT TECHNIQUE DANS L’IDENTIFICATION DES ASC HUMAINES DANS LES TISSUS MURINS
CHAPITRE 1. OBJECTIF DU TRAVAIL
CHAPITRE 2. MATERIELS ET METHODES
2.1. Les prélèvements tissulaires
2.1.1. Isolement de la FSV à partir du tissu adipeux humain
2.1.2. Culture et obtention des ASC
2.1.3. Les animaux
2.1.4. Protocole d’injection des cellules
2.1.5. Prélèvement des tissus murins
2.1.6. Préparation de lames cytologiques
2.1.7. Choix des lames à marquer
a. Lames témoins
b. Echantillons
2.2. Protocole de marquage cellulaire des CSM adipeuses humaine par la technique d’hybridation in situ en fluorescence (HIS)
2.2.1. Choix de la sonde ADN
2.2.2. Protocole de couplage d’une sonde Cot-DNA à la biotine
a. Préparation des échantillons à marquer
b. Dénaturation
c. Hybridation des promoteurs et synthèse des brins d’ADN marqués à la biotine
d. Précipitation des sondes marquées
2.2.3. Protocole d’hybridation in situ adapté aux coupes histologiques
a. Déparaffinage
b. Etapes de prétraitement
c. Dénaturation
d. Hybridation
e. Lavage stringent
f. Révélation
2.3. Protocole de marquage immunohistochimique des ASC humaines sur tissu murin à l’aide des marqueurs Ku80 et hMito
2.3.1. Ku80
2.3.2. hMito
2.4. Lecture et numérisation des lames
2.4.1. Première lecture au microscope
2.4.2. Numérisation
CHAPITRE 3. RESULTATS
3.1. Validation des marqueurs Cot-1 DNA, Ku80 et hMito
3.1.1. Validation de la spécificité du marquage Cot-1 DNA sur la base des contrôles positifs et négatifs sur cytologie et coupes tissulaires en paraffine
3.1.2. Validation de la spécificité des marquages Ku80 et hMito sur la base des contrôles positifs et négatifs en histologie
3.1.3. Localisation sub-cellulaire des marqueurs Ku80, hMito et Cot-1 DNA
3.1.4. Répétabilité des techniques de marquage
3.1.5. Etude des marquages indésirables (bruit de fond, marquage non spécifique, réactivité croisée)
3.2. Application à une étude de biodistribution après injection locale (intramusculaire ou sous-cutanée) ou systémique (IV rétro-orbitaire)
3.2.1. Evaluation de la biodistribution des ASC humaines dans les tissus murins
3.2.2. Evaluation de la morphologie des ASC humaines en fonction de la cinétique
3.2.3. Observation de différentiation vasculaire des ASC
3.2.4. Evaluation de la répartition/diffusion des ASC après administration locale…88 CHAPITRE 4. DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
