PRINCIPES GENERAUX DE LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE, LA RMN 

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Découverte de la voie des pentoses phosphates (PPP) :

En 2014, Keller et al. ont montré que l’origine de la voie des pentoses phosphates semblait dater de la période océanique prébiotique de la terre. Dans une reconstitution, la PPP originelle a été catalysée par une enzyme dans laquelle le Fe(II) joue le rôle de cofacteur. L’élément inorganique, qui est abondant dans l’océan, facilitait l’interconversion des sucres phosphatés. Néanmoins, l’oxydation du glucose-6-phosphate (G6P) en lactone (6PGL) n’était pas observée.13
La voie des pentoses phosphates fut la troisième voie métabolique à avoir été mise en évidence, après la glycolyse (Embden-Meyer-Parnas pathway) et le cycle de Krebs (le cycle de l’acide tricarboxylique).1 Dans les années 1930, les premières réactions successives de transformation d’un hexose phosphate en un pentose phosphate ont été décrites. Warburg, Dickens et Lipmann découvraient l’existence des deux coenzymes, le NADP+ et le NAD+, qui participaient à l’oxydation du glucose-6-phosphate (G6P) en 6-phosphogluconate (6PGA) et la décarboxylation du 6PGA en un pentose phosphate.14,15,16 A cette époque, la nature précise de ce pentose phosphate n’a pas été identifiée (Figure 3).
Vingt ans plus tard, grâce à des études de spectrophotométrie, le ribulose-5-phosphate (Ru5P) a été identifié comme étant le produit de la décarboxylation du 6PGA. Horecker découvre par la même occasion que le Ru5P s’isomérisait en ribose-5-phosphate (R5P) en présence de l’isomérase 5 phosphate.17 Suite aux travaux réalisés par Z. Dische en 1938 sur des extraits de moelle osseuse de lapin, montrant que le ribose-5-phosphate se convertit en un hexose mono-phosphate, Horecker et Seegmiller ont supposé que cette voie métabolique était cyclique.18,17 Ce métabolisme oxydatif composé de 4 enzymes, produit une molécule de dioxyde de carbone et une molécule de pentose phosphate à chaque cycle. Le pentose phosphate produit un hexose phosphate pour qu’il devienne à son tour le substrat de la « voie oxydative » (Figure 4). Ainsi, 6 cycles sont nécessaires pour oxyder une molécule de glucose. Cette hypothèse fut avancée alors que l’ensemble des réactions enzymatiques responsables de cette voie métabolique était encore inconnu. 19
Parallèlement, Cori et Lipmann montraient que le produit de l’oxydation du G6P catalysée par la G6PDH était la δ-6-phosphogluconolactone (δ-PGL) et non la 6PGA.20 En présence d’une hydroxylamine, la δ-PGL se transformait en acide hydroxylamique. En revanche, en absence de l’hydroxylamine, cette lactone s’hydrolysait spontanément en un acide phosphogluconate (6PGA).20 Ce n’est que quatre ans plus tard, qu’une équipe de Boston montre pour la première fois une activité enzymatique qui hydrolyse la δ-6PG en 6PGA.21 La première dénomination se réalise quant à elle 9 ans plus tard (Figure 5).22
L’hypothèse émise par Horecker et Seegmiller fut remise en cause, lorsque E. Racker, P. Smyrniotis and H. Klenow se sont intéressés à la découverte d’un sucre à 3 carbones, le glycéraldehyde-3-phosphate (G3P) dans les précédentes recherches.23,24 En utilisant la réaction d’orcinol de Dische25 avec des enzymes purifiées provenant de foie de rat, ils montrent que le Ru5P était également transformé en un sedoheptulose monophosphate (S7P)
à l’aide d’une transcétolase. Cependant, une différence de stéréochimie avec le carbone hydroxyle sur le troisième carbone du S7P et du Ru5P a été observée. Cette incompréhension fut résolue par P. Stumpf qui a mis en évidence une « épimerase », qui convertit le Ru5P en un xylulose-5-phosphate (Xu5P).26 Ainsi, la stéréochimie entre le Xu5P et le S7P est conservée. Le 6-phosphogluconate est donc oxydé en Ru5P, qui est lui-même converti en Xu5P et R5P par une épimérase et une isomérase. Ces deux sucres ainsi formés sont ensuite transformés en S7P et G3P par une transcétolase.
Finalement, Horecker et ses collaborateurs ont montré que le S7P se combinait avec un triose phosphate pour former un hexose monophosphate et un fragment phosphate à 4 carbones. Avec l’aide de H. Barker, ils ont démontré, en utilisant des enzymes et un triose phosphate uniformément marqué en carbone 13, que l’hexose phosphate formé était en fait un fructose-6-phosphate (F6P). Cette réaction était alors catalysée par une enzyme nommée “transaldolase”.27 Peu de temps après, ils identifient le fragment phosphate à 4 carbones comme étant l’érythrose-4-phosphate (E4P) et montrent également que le S7P peut se condenser avec une dihydroxyacétone phosphate via le fructose biphosphate aldolase (DHAP).
La voie des pentoses phosphate est une voie de dégradation du glucose-6-phosphate et elle est catalysée par des enzymes sophistiquées, excepté la conversion de -PGL en 6PGA, qui peut être spontanée.14,28,21 Cette voie métabolique se réalise dans le cytosol pour la plupart des organismes et dans d’autres organelles, tels que les plastes pour les plantes, les peroxysomes et les glycosomes pour les parasites.29,30 Cette cascade enzymatique se compose de deux étapes :
(i) une voie oxydative dans laquelle trois réactions enzymatiques irréversibles convertissent un hexose phosphate, le glucose-6-phosphate (G6P), en un dioxyde de carbone et un pentose phosphate, le ribulose-5-phosphate (Ru5P), avec une production de 2 NADPH .
(ii) une voie non-oxydative dans laquelle 5 réactions enzymatiques réversibles transforment un pentose phosphate en un hexose phosphate, F6P, et un G3P.

L’étape oxydative de la voie des pentoses phosphates :

Le substrat initial de la PPP, le G6P, est commun à trois autres voies métaboliques : la glycolyse, la biosynthèse des hexosamines et la glycogenèse. En fonction des besoins de la cellule, le G6P est métabolisé par l’une de ces quatre voies métaboliques. Une fois que le glucose est entré dans la cellule via ses transporteurs membranaires (Glut), le sucre est directement phosphorylé en G6P par une hexokinase (HK) en présence d’un ion Mg2+ et d’ATP comme source de phosphate (Figure 8).31
Figure 8 : Entrée du glucose via un transporteur membranaire, Glut-1, dans la cellule. Le glucose est phosphorylé par l’hexokinase, utilisant l’ion magnésium Mg2+. A forte concentration, le G6P formé est un inhibiteur de la HK (rétro-contrôle négatif). Les quatre voies métaboliques qui utilisent le G6P sont représentées sur ce schéma, ainsi que les métabolites importants qu’elles produisent.
Lorsque la cellule a besoin de NADPH et de ribose-5-phosphate, qui sont tous deux des précurseurs pour la biosynthèse des acides nucléiques et des nucléotides, le flux métabolique de la PPP augmente. Le G6P sera dans un premier temps converti dans une voie oxydative en un ribulose-5-phosphate (Ru5P) avec une production de 2 équivalents de NADPH. Cette étape est réalisée par trois enzymes, la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD), la 6-phosphogluconolactonase (6PGL) et la 6-phosphogluconate déshydrogénase (6PGD). Pour la première et la troisième réaction, les enzymes ont besoin d’un coenzyme, le NADP+, pour catalyser l’oxydation du G6P en δ-6-phosphogluconolactone et la décarboxylation de la 6PGA en Ru5P. Ainsi, 2 molécules de NADP+ sont réduites en 2 molécules de NADPH (Figure 9).32
Figure 9 : Voie oxydative de la PPP qui se compose de trois enzymes: la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD), la 6-phosphogluconolactonase (6PGL) et la 6-phosphogluconate déshydrogénase (6PGD). Deux équivalents de NADP+ sont réduits en NADPH lors de la première et la troisième réaction enzymatique. Le G6P est donc oxydé en δ-6-phosphogluconolactone (δ-PGL), puis hydrolysé en 6-phosphogluconate (6PGA) et décarboxylé en ribulose-5-phosphate (Ru5P).

La glucose-6-phosphate déshydrogénase, la G6PD :

La glucose-6-phosphate déshydrogénase a été l’une des enzymes les plus étudiées à cause de son rôle majeur dans la cellule : régulateur de nombreuses voies métaboliques biosynthétiques.2 Cette enzyme clé de la voie oxydative de la PPP, catalyse la déshydrogénation du glucose-6-phosphate en une δ-6-phosphogluconolactone à l’aide de la réduction d’un équivalent de NADP+ en NADPH.
La G6PD possède un autre substrat que le glucose-6-phosphate (G6P), le galactose-6-phosphate (GA6P).33 La vitesse d’oxydation du GA6P étant très faible comparée à celle du G6P, ce substrat est souvent négligé. Les coenzymes, qui sont des molécules non protéiques participant activement à l’activité de l’enzyme, ici la G6PD, sont des nicotinamides adénines dinucléotides qui sont phosphorylés (NADP+) ou non (NAD+). Le choix de fixation du coenzyme dépend de l’espèce. Trois groupes ont été définis en fonction du co-enzyme choisi, Tableau 1.
L’affinité du coenzyme et du substrat pour l’enzyme dépend des conditions de l’expérience (nature du tampon utilisé et pH), mais pas du type de coenzyme préférentiel (Tableau 2).2 Un troisième site de fixation, loin du site actif, permet la fixation d’un second coenzyme dans chaque unité. Cette deuxième fixation du coenzyme maintient la conformation active de la G6PD (Figure 10). Cette liaison stabilise l’enzyme.36 La G6PD est active entre 30 et 92°C, avec une température d’activité optimale à 50°C, et à un pH compris entre 6,6 < pH < 9,2. 2
L’un des inhibiteurs commun à toutes les espèces est le coenzyme lui-même sous sa forme réduite. Le NADPH inhibe de manière efficace l’ensemble des trois groupes et pour chaque type d’organisme : animaux,37 bactéries,38,39 levures,40,41,42 et plantes43 … Il se comporte généralement comme un inhibiteur compétitif. Pour le troisième groupe, comme dans les Leuconostoc mésentéroïdes, qui acceptent aussi bien le NADP+ que le NAD+, le rapport de concentrations en cofacteur réduit (NADPH ou NADH) et en substrat (G6P) détermine le type d’inhibition. Lorsque la concentration en NADP+ varie, le NADPH inhibe linéairement de manière compétitive l’enzyme. A l’inverse, lorsque c’est la concentration du substrat qui varie, le NADPH inhibe l’enzyme linéairement de manière non compétitive.35 Lorsque le coenzyme est le NAD+, et que la concentration en G6P varie, le NADH inhibe la G6PD de manière compétitive quel que soit la concentration de NAD+.35 Autre exception à la règle, des recherches réalisées par Haghighi et ses collaborateurs 44 ont montré que chez le S aureofaciens, le NADH est un inhibiteur compétitif tandis que le NADPH est un inhibiteur non compétitif.
Une enzyme similaire à la G6PD a été découverte dans les microsomes, vésicules issues du réticulum endoplasmique (RE) qui est le lieu de synthèse des protéines.1 L’héxose-6-phosphate déshydrogénase (H6PDH)45,46 est moins spécifique pour le substrat et n’a aucune préférence pour un coenzyme. En plus du G6P, l’enzyme peut catalyser l’oxydation du glucose, du galactose-6-phosphate et du 2 deoxyglucose-6-phosphate.47,46 Cependant, en raison d’une forte concentration de NADPH dans la lumière du RE, il a été établi que le G6P et le NADP+ sont les substrats préférentiels à la H6PDH. Les localisations alternatives de la PPP en dehors du cytosol montre que le NADPH est un précurseur important dans la biosynthèse des protéines.1

NADPH, substrat de nombreuses biosynthèses

Le NADPH est donc l’un des substrats principal de nombreuses biosynthèses tels que les acides nucléiques (donc de l’ADN et de l’ARN), les acides gras, les acides aminés aromatiques, les isoprénoïdes. Excepté pour le globule rouge, le NADPH peut également être produit via les enzymes maliques, des aldéhydes déshydrogénases et des isocitrates déshydrogénases.
La déficience de la G6PDH peut donc provoquer des perturbations sur les autres métabolismes cellulaires. Des études ont montré que la G6PDH est activée par l’insuline, hormone protéique sécrétée par les cellules β des îlots de Langerhans dans le pancréas et régulatrice avec le glucagon de la concentration en glucose dans le sang. Cette hormone régule entre autre la glycolyse. Chez les patients atteins du diabète de type 1, les cellules pancréatiques produisent très peu d’insuline. L’expression de la G6PDH est restreinte mais le niveau de glucose est important. Ainsi, la concentration de NADPH est réduite, les ROs augmentent et la prolifération cellulaire est altérée.64 Les cellules ne sont plus protégées contre le stress oxydant. Sans prise d’insuline, cette maladie peut être mortelle.
D’autres études ont montré que la déficience de la G6PDH pouvait être une conséquence de la résistance à l’insuline et la cause du diabète de type 2 ;65 dont ces patients souffrent généralement d’une hypertriglycéridémie et d’une hypercholestérolémie. Les concentrations d’acides gras libres et de triglycérides sont généralement plus faibles chez les sujets déficients en G6PDH.66

Inhibiteur de la G6PDH

L’activité de la G6PDH est également régulée par le rapport NADP+/NADPH. En fonction des besoins cellulaires, le flux de la PPP est augmenté, le ratio NADP+/NADPH diminue et la concentration intracellulaire du NADPH augmente. Ce NADPH est un inhibiteur qui se fixe à la place du NADP+. Le NADPH ne permet pas de stabiliser l’enzyme. L’activité de la G6PDH est donc réduite. Des études ont montré que la G6PDH ne fonctionne qu’à 1-2 % de son potentiel maximal en raison du haut niveau de NADPH dans les conditions de repos. Lorsque le NADPH est consommé par les différents métabolismes dont il est le substrat, le rapport NADP+/NADPH diminue et ainsi l’activité de la G6PDH augmente.

Régulation de la G6PDH

La G6PD est une enzyme-clé dans le métabolisme cellulaire en raison de sa production du NADPH et de pentoses phosphates qui participent à de nombreuses biosynthèses ainsi qu’à la division cellulaire. La régulation de son activité est donc primordiale pour la cellule. Son activité est régulée par différents facteurs tels que :

Les facteurs nutritionnels et hormonaux:

Un régime riche en glucide stimule la production d’insuline via la voie des phosphatidylinositol-3-kinase, induisant une accumulation de l’ARNm du G6PD. A l’inverse un régime riche en acides gras polyinsaturés tels que l’acide arachidonique inhibe la signalisation de l’insuline par l’activation des protéines kinases activées par les mitogènes p38 (p38MAPK) et la phosphorylation de la Ser307 du récepteur à l’insuline (IRS-1). L’ARNm de l’enzyme est donc inhibé.67

Les facteurs liés au stress oxydatif :

Le stress oxydatif s’accompagne de la présence accrue de ROs. Les agents responsables de la production des radicaux régulent eux-mêmes les enzymes requises pour protéger les cellules contre les dommages causées par les radicaux.68

autres facteurs :

e.g., les rayons lumineux inhibent l’enzyme via l’activation du système ferrédoxine/thiorédoxine. Des études montrent qu’une délétion ou une inhibition de l’enzyme entrainent une mort cellulaire communément appelée apoptose.69 L’inhibition de la G6PDH entraine également une augmentation des peroxydes hydrogène, la perte de protéine thiols ainsi que des modifications des protéines kinases phosphorylées activées par les mitogènes.70 La déficience en G6PD est généralement associée à des nombreuses maladies.

Déficience de la G6PDH

Aujourd’hui, 400 000 000 de personnes à travers le monde possèdent une déficience de la G6PDH à travers 217 mutations possibles.51,71,48 Environs 400 phénotypes ont répertoriés en 5 classes en fonction de l’activité de l’enzyme et des manifestations cliniques. Dans plusieurs cas, l’enzyme mutée est moins stable, adopte un mauvais repliement et présente des paramètres cinétiques anormaux (km G6P, NADP+, affinité et dépendance au pH).
Comme expliqué précédemment, les globules rouges (GR) sont les premières cellules touchées par la déficience en G6PDH. Les globules rouges permettent de transporter l’oxygène des poumons vers l’ensemble du corps. Une déficience de la G6PDH, qui se produit généralement chez les hommes, provoque systématiquement une dégradation des globules rouges. Lorsque la destruction des GR est plus rapide que leur construction, ce phénomène se nomme anémie hémolytique. Cette destruction rapide des GR peut être déclenchée par des infections bactériennes ou virales, après inhalation du pollen issu des plantes de fava, après avoir mangé des fèves et par la prise de médicaments générant du stress oxydant comme les anti-malariaux.
Le NADPH et le R5P sont les deux précurseurs des biosynthèses des acides nucléiques et donc de l’ADN et de l’ARN. Généralement les cellules en mitose et en méiose ont un flux de la voie des pentoses phosphate accru en raison des besoins de ces deux précurseurs. Les cellules cancéreuses qui sont continuellement en division cellulaire, sont les premières concernées par la nécessité en NADPH et en R5P. D’ailleurs, 80 % des pentoses sont incorporés dans leurs ADN.
Les études fonctionnelles et structurales de cette enzyme, dans sa forme sauvage ou sa forme mutée, sont donc primordiales pour comprendre son fonctionnement dans le but de développer des stratégies thérapeutiques.

La 6-phosphogluconolactonase, la 6PGL :

La 6 phosphogluconolactonase est la deuxième enzyme de la voie oxydative de la PPP.
Cette enzyme catalyse l’hydrolyse de la δ-6-phosphogluconolactone en 6-phosphogluconate.
Cette transformation peut également se réaliser sans enzyme (en absence de 6PGL).
La 6-phosphogluconolactonase est une des enzymes de la PPP qui a été très peu été étudiée. Pendant de nombreuses années, de nombreux chercheurs considéraient que l’hydrolyse de la -6-phophogluconolactone ( -PGL) était spontanée. Dès la découverte de la voie des Pentoses Phosphate, Warburg et al pensaient d’ailleurs que le produit de l’oxydation du G6P était l’acide phosphogluconate (6PGA). Vingt ans plus tard, Cori et Lipman montraient seulement que le produit de l’oxydation du G6P catalysée par la G6PDH était la δ-6-phosphogluconolactone.20 De plus, ils constataient qu’en présence d’une hydroxylamine, le produit obtenu se transformait en acide hydroxylamique mais qu’en l’absence de l’hydroxylamine, elle s’hydrolysait spontanément en un acide phosphogluconate.20 Ce n’est que quatre ans plus tard, qu’une équipe de Boston montre pour la première fois une activité enzymatique qui hydrolyse la -PGL en 6PGA.21
L’étude de l’activité de la 6PGL est complexe dans la mesure où l’hydrolyse de la δ-lactone s’effectue en l’absence de l’enzyme. Le substrat de la 6PGL est donc très instable en milieu aqueux. C’est pourquoi de nombreux chercheurs ont jugés que l’étude détaillé de la 6PGL ne présentaient pas d’intérêt majeur.72 Pourtant, certaines équipes ont tenté de caractériser les propriétés cinétiques de cette enzyme. Pour pallier à l’instabilité de la lactone, un substrat analogue, la γ-6-phosphogluconolactone ( -PGL), a été synthétisé (Figure 12).73 Des études ont montré que cet homologue est beaucoup plus stable et possède une plus grande affinité pour l’enzyme.73 Les études réalisées sur des érythrocytes ont montré que la déficience de la 6PGL interagissait avec la déficience de la G6PDH dans les anémies hémolytiques.72
En 1974, Ueberschar et al ont montré que le second substrat de la 6PGL, γ-PGL, pouvait être produit par l’isomérisation spontanée de la δ-PGL sans passer par la forme ouverte de l’acide phosphogluconate.74 Ce n’est qu’en 2001, que des études réalisées par 13C-RMN ont montré que la δ-PGL était le seul substrat de la 6PGL. En absence de l’enzyme, la δ-PGL s’isomérise plus rapidement en γ-PGL, qu’elle ne s’hydrolyse en 6PGA.75 Dans les conditions expérimentales de l’étude menée, l’isomérisation est réversible et la γ-PGL ne peut pas (ou très faiblement) s’hydrolyser spontanément. Ces résultats ont également montré que les deux lactones, qui sont très électrophiles, peuvent réagir avec des nucléophiles potentiels, comme les hydroxylamines, provoquant ainsi des dommages à la structure cellulaire et au métabolisme par l’altération structurale et catalytiques des protéines.75 La 6PGL possède donc un rôle important dans la protection cellulaire.
Chez l’homme la 6PGL est composée 258 acides aminés76 avec un poids moléculaire de 31 kDa sous sa forme native et de 30 kDa à pH 6.73 Des études réalisées sur des lysats d’érythrocytes73 ont montré que l’activité de la 6PGL était dépendante du pH :
5.8 < pH < 7.2, la vitesse de la 6PGL augmentent de 0.03 à 0.13 mol.min-1 pH = 7.4, la vitesse de la 6PGL est maximale et égale à 0.15 mol.min-1.
7.6 < pH < 8.2, la vitesse de la 6PGL diminue de 0.14 à 0.08 mol.min-1.
En l’absence de l’enzyme, l’hydrolyse spontanée est également dépendante du pH :
pH < 7.0, la vitesse de l’hydrolyse spontanée est faible et d’~ 5 nmol.min-1.
pH > 7.0, la vitesse de l’hydrolyse spontanée augmente d’~ 5 nmol.min-1 à ~ 0.05 mol.min-1.
De plus, la concentration en hexoses monophosphate ainsi que le rapport des concentrations entre [NADP+]/[NADPH] obtenus sont très faibles. Les résultats indiquent que dans ces conditions physiologiques la réaction d’oxydation catalysée par la G6PDH est inhibée à moins que la concentration en 6PGL soit au moins de 10 nmoles.g-1. Ces résultats montrent que la 6PGL est essentielle dans le maintien du rapport [NADP+]/[NADPH].73
Au cours de ce sous chapitre, nous avons montré que les deux premières enzymes de l’étape oxydative de la PPP sont cruciales à la survie cellulaire en raison de leurs implications dans la production de précurseurs à de nombreuses biosynthèses. Un quelconque dysfonctionnement sur cette voie peut avoir des conséquences dramatiques pour la cellule. Ces deux enzymes sont donc des cibles potentielles pour l’élaboration de nouveaux médicaments contre les maladies liés à ces deux enzymes comme le favisme ou le cancer. Par ailleurs, leur étude est également pertinente dans le cadre des maladies infectieuses.

Maladies Infectieuses liées à la PPP :

Les parasites protozoaires sont des organismes unicellulaires qui vivent aux dépens d’un hôte en se nourrissant essentiellement des tissus, des aliments et du sang. Cette intrusion est responsable d’un bon nombre d’infections et de maladies chez l’homme dans les pays en développement. Trois classes existent :
1. les kinétoplastides : ce sont des eucaryotes euglénozoaires parasites non pigmentés qui ont un ou deux flagelles et un kinétoplaste volumineux. Ils n’ont qu’une seule mitochondrie. Deux groupes constituent cette famille : (i) les trypanosomatidés, qui possèdent un seul flagelle et une membrane ondulante pour se mouvoir ; (ii) et les bododina qui possèdent deux, voire trois flagelles. Les kinétoplastides les plus connus sont les trypanosomes brucei, les trypanosomes cruzei et les Leishmania spp qui sont respectivement responsables de la maladie du sommeil, de la maladie de Chagas et de la Leishmaniose.77
2. Les plasmodiums ou acanoidasida sont responsables de la malaria.
3. Les archeamobeans sont responsables d’amoebiasis – une forme de diarrhée aigüe ainsi que des abcès, principalement dans le foie.
La relation hôte-parasite, le processus d’infection et l’identification des cibles thérapeutiques dépendent fortement du métabolisme du protozoaire. Les systèmes immunitaires de l’organisme hôte luttent contre le parasite grâce aux ROs. La génération des ROs étant liée à la production de NAPDH via la PPP, cette information nous montre que la PPP peut donc être une cible attractive pour la lutte contre ces parasites.

Les kinétoplastides :

Ces parasites possèdent une voie des pentoses phosphates complète et fonctionnelle. Elle métabolise 5 à 10 % du glucose total dans le cytosol mais également dans le glycosome, un peroxisome trypanosomatide, qui contient majoritairement les enzymes de la glycolyse et du système oxydatif du parasite et exclusivement celles de la biosynthèse des nucléotides. La PPP possède donc ici trois rôles majeurs : (i) elle échange des intermédiaires réactionnels avec la glycolyse. (ii) Elle produit le R5P, précurseur de la biosynthèse des nucléotides et (iii) elle forme le réducteur NADPH pour le système antioxydant.
Le système oxydatif repose exclusivement sur le système N1-N8-bisglutathionylspermidine (T(SH)2)/ trypanothione reductase (TryR) qui est NADPH dépendant. T(SH)2 est un analogue au glutathion. Cette réponse au stress oxydatif qui remplace le système GSH/GR montre encore une fois une dépendance du système oxydatif de la PPP et l’importance de cette dernière. Des études réalisées sur la G6PDH des trypanosomes78 ont montré que dans les formes infectieuses de la Trypanosoma cruzei, 70 µM de H202 augmentent l’activité de la G6PDH par un facteur 46. A l’inverse, dans les formes insectes (natives) l’activité de l’enzyme diminue en présence de 20 µM de H202. Barret montre également que la 6PGD joue un rôle important dans la PPP des trypanosoma brucei. Une délétion sur cette enzyme et sur la G6PD montre un phénotype létal lorsque la 6PGA s’accumule dans la cellule.79
Ces résultats montrent que la PPP des kinétoplastides, qui se déroule en partie au sein du glycosome constitue une cible thérapeutique potentielle.

Les plasmodium spp :

Les plasmodium spp possèdent une voie des pentoses phosphates complète et fonctionnelle. Cependant, ce parasite possède une particularité. Sa voie oxydative de la PPP n’est composée que de 2 enzymes : la 6-phosphate déshydrogénase 6-phosphogluconolacto–nase (GluPho)- qui fusionne la G6PDH et la 6PGL – et la 6PGD. La GluPho synthétise le 6-phosphogluconate à partir du glucose-6-phosphate avec la réduction d’un équivalent de NADP+ en NADPH. Cette enzyme « fusion » est régulée par la S-glutathionylation qui est impliquée dans le stress oxydatif.80 D’autres enzymes combinant la G6PDH avec d’autres enzymes de la PPP ont été retrouvées dans le parasite. Cette originalité indique une efficacité de la PPP dans la synthèse des métabolites majeurs du métabolisme.81
Dans les globules rouges, ces parasites sont constamment soumis au stress oxydatif. Ils produisent des radicaux hydroxyl et du H202 grâce à l’oxydation de Fe2+ en Fe3+ via l’hémoglobine et la production d’anions superoxides. Le système anti-oxydant de ces parasites implique la glutathion réductase et la thioredoxine réductase, qui sont toutes les deux NADPH dépendantes. Sachant que le R5P peut également être produit à partir de l’absorption et la dégradation des purines hôtes, PPP est la seule source de NADPH chez les plasmodium spp.
Pour le Plasmodium le plus dangereux, le Plasmodium falciparum, qui cause le paludisme chez l’homme, la PPP est indispensable pendant l’infection. Dans les globules rouges infectés, l’activité de la PPP parasitaire représente 82 % de l’activité totale et 72 % pour les globules rouges déficient en G6PDH.82 Cette activité est encore plus importante lorsque le parasite est dans sa période de maturation, également appelée (étape) trophozoïte.82 Des études ont montré que la déficience en G6PDH protège contre la malaria.83,84 Environ 46 % des femelles hétérozygotes et 58 % des mâles hémizygotes ont augmenté cette résistance.85 Ce phénomène n’est pas totalement compris, et deux hypothèses ont été proposées : (i) Le stress oxydatif important dû à la déficience en G6PDH serait responsable d’une perturbation de l’infection, (ii) les érythrocytes infectées sont plus facilement reconnues et détruites par le système immunitaire.86

Entemobea histolytica :

L’entamobea histolytica possède très peu de G6PDH, 6PGDH et de TAL.79,87 Ce parasite a donc développé une voie d’interconversion hexose-pentose alternative à la voie oxydative de la PPP. Ce métabolisme alternatif est composé de 3 enzymes : une transketolase (TKL), une fructose-biphosphate aldolase (FBA) et d’une pyrophosphate dépendant phosphofructokinase ((PPi)PFK).88 Lorsque le parasite est soumis au stress oxydatif, la production des métabolites de la voie non oxydative de la PPP, la biosynthèse du glycérol et de la chitine est augmentée. Ce phénomène est dû à l’inhibition des enzymes glycolytiques et favorise également le retour du flux de carbone.87 La voie non oxydative de la PPP joue un rôle indépendant de NADPH dans la réponse du stress oxydatif.89

Maladies provoquées par les bactéries :

La bactérie est un organisme unicellulaire et sans noyau dont le génome est constitué d’un seul chromosome. Parfois, elle se compose d’un plasmide. Ces organismes sont pour la plupart pathogènes pour l’homme. Lorsqu’une bactérie infecte l’homme, les mécanismes de défense nécessaires à la survie se déclenchent. Des capteurs microbiens activent des voies signalétiques ainsi que des effecteurs. Récemment, une étude a montré qu’une kinase nommée SHPK modulait la régulation des macrophages. L’expression de SHKP est associée à la polarisation de macrophage 1 (M1). Mais une surexpression de la kinase induit par la réponse pro-inflammatoire est associée à une production de radicaux superoxides. Ce phénomène est similaire à la réponse neutrophile en réponse au système immunitaire.90 Des études réalisées sur des H. pylori ont montré que l’activation rapide des neutrophiles augmentait la production des DROs.91 Les niveaux de GSH sont ainsi augmentés et cela montre que le système glutathion est également une réponse auto-immune.92
La bactérie possède aussi bien une PPP qu’une voie glycolytique. Ces deux voies sont d’ailleurs les constituants majeurs du métabolisme des carbones dans les bactéries.93 La PPP possède les mêmes rôles que chez les eucaryotes, mais avec une fonction supplémentaire : l’initiation de la biosynthèse des lipopolysaccharides (LPS) par le sédoheptulose-7-phosphate.
De plus, le D-xylose, D-ribose et le L-arabinose ne sont catalysés que par la PPP.28,93 Lorsque la bactérie infecte l’hôte, la bactérie doit s’adapter en fonction de sa localisation dans l’organisme. Selon l’environnement cellulaire ou tissulaire, les nutriments diffèrent. Le métabolisme, la structure intra- et extra-cellulaire, et la croissance bactérienne s’adaptent à ce changement et la virulance de la bactérie est dépendante de cette localisation.
La PPP joue un rôle central dans la biosynthèse des lipopolysaccharides (LPS) qui recouvrent la surface externe des membranes bactériennes. Les LPS ne protègent pas seulement la bactérie mais ils induisent l’activation de la réponse auto-immune.94 De nombreuses recherches ont été effectuées sur ces LPS pour trouver des nouveaux agents thérapeutiques. Une des cibles a été la sédoheptulose-7-phosphate isomérase (SHI) qui permet de transformer le sédoheptulose-7-phosphate provenant de la PPP en un précurseur lipopolysaccharidique, le glycero-manno-heptose-7-phosphate95,96,97 et l’arabinose 5-phosphate isomérase (API) qui convertit le ribulose-5-phosphate provenant de la PPP en un précurseur lipopolysaccharidique l’arabinose-5-phosphate.98

Méthodes analytiques pour caractériser la PPP :

Afin de juger l’influence d’une perturbation sur l’une des enzymes de la PPP dans une cellule, perturbation qui peut être induite par des facteurs internes cellulaires ou externes, il est important de connaître le fonctionnement et la régulation de cette cascade enzymatique dans l’état natif. Dans ce but, le choix de la technique d’analyse qualitative et quantitative est important. L’observation de la PPP est délicate en raison de la faible concentration des métabolites intermédiaires dans la cascade enzymatique.99 L’accumulation de ces métabolites est entravée par des transformations rapides en aval de la chaine enzymatique, car les constantes de temps correspondant aux transformations qui consomment ces intermédiaires sont de l’ordre de la seconde ou moins.100,101,102 Afin de détecter l’ensemble des acteurs de la PPP, la méthode d’observation doit être sensible, non-invasive, simple, et elle doit également posséder une résolution temporelle suffisante pour différencier ces métabolites.
De nombreuses techniques (telles que des essais colorimétriques, des mesures fluorimétriques et spectroscopiques)103,104,99,105 ont été choisies pour réaliser les mesures quantitatives. Différentes sondes ont été testées : en RMN le [U-13C]-Glucose et le [U-2H]-Glucose, en traçage radioactif le [U-14C]-Glucose.106,107 En UV-Vis, des sondes indirectes comme le NADPH ont également été utilisées. Le marquage du substrat est nécessaire pour l’observation RMN afin d’éliminer les autres signaux provenant des molécules présentes dans la cellule. La technique la plus performante à cette date pour décrire la PPP est la spectrométrie de masse couplée à une méthode chromatographique (LC, CPG, HPLC). Cette méthode sensible, sélective et robuste a permis de déterminer les concentrations absolues de l’ensemble des sucres phosphorylés de la PPP.108 Cependant, l’inconvénient principal de cette technique est qu’elle n’est pas applicable à des études in vivo en temps réel.
Récemment, le potentiel analytique de la RMN a été substantiellement amélioré par l’invention des méthodes dites d’hyperpolarisation pour la résonance magnétique à haute résolution 5,109. A l’état liquide, l’hyperpolarisation par DNP suivie de dissolution 5 permet d’observer des voies métaboliques in vivo en temps réel, de manière non-invasive. Sa capacité d’augmenter le signal des molécules par un facteur 10’0005 comparé à des mesures identiques effectuées sans hyperpolarisation permet de détecter des signaux provenant de molécules en faibles concentrations dans un système complexe. Cette nouvelle technique a permis l’observation7 et l’identification des métabolites impliqués dans les voies métaboliques110 et la quantification des métabolites présents dans un extrait cellulaire.111 Le seul inconvénient de cette technique est sa dépendance critique de la durée de vie de l’aimantation. Cette durée de vie est dictée par les constantes de temps de relaxation longitudinale des noyaux hyperpolarisés. Ces durées de vie sont, pour des noyaux choisis pour optimiser l’expérience, dans des molécules endogènes typiques pour la finalité de ces expériences, in vivo, – e.g. observation du pyruvate via son carbone-1 enrichi isotopiquement – de l’ordre de 30 s.1 Nonobstant cette limitation, cette méthode a déjà prouvé un panel varié d’applications comme l’injection de molécules hyperpolarisées directement dans le flux sanguin et le suivi du devenir de cette molécule par IRM pour le diagnostic d’un cancer de la prostate.112,10 La détermination des quantités de molécules endogènes présentes dans un flux métabolique est rendue possible grâce au développement de la D-DNP.113
Dans le contexte de la chimie analytique, la Polarisation Dynamique Nucléaire suivie de dissolution (D-DNP pour Dissolution-Dynamic Nuclear Polarisation) est l’une des méthodes d’hyperpolarisation privilégiées pour l’observation des réactions cinétiques.4,114 Cette méthode repose sur l’hyperpolarisation du substrat à l’état solide, substrat qui est ensuite dissout et injecté dans un aimant de détection qui contient le matériel nécessaire à la réaction enzymatique. La première étude quantitative sur une réaction enzymatique simple a été l’hydrolyse du N-Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester (BAEE) catalysée par la trypsine, une endoprotéase issue du pancréas ; cette expérience a été réalisée par Bowen et Hilty en 2008.115 Le signal obtenu après détection a été normalisé à l’aide de valeurs de référence obtenues en absence de l’enzyme. Cette procédure permet d’éliminer les effets de la relaxation longitudinale pendant le temps de réaction. Grâce à cette méthode, Bowen & Hilty ont extrait directement la constante catalytique par une multiplication de la pente de la courbe représentant le ratio intensité expérimental/intensité référence en fonction du temps par le ratio Csubstrat/Cenzyme. Pour montrer le potentiel de la D-DNP, une expérience similaire a été réalisée par UV-spectrophotométrie. Des valeurs kcat = 12,1 ± 1 s-1 et 12,5 s-1 ont été obtenues par D-DNP et UV-vis, respectivement.115 Ces résultats montrent qu’il est donc possible de quantifier par D-DNP des réactions enzymatiques. Cependant, ce modèle de quantification a été appliqué à un système enzymatique simple. La quantification d’un système plus complexe doit prendre en compte l’évolution de la concentration des métabolites au cours de la réaction, la relaxation longitudinale de chaque métabolite, la méthode d’acquisition et le mélange de la solution lors de l’injection, qui peuvent fausser le signal lors de l’expérience.116 Il est donc nécessaire de développer un programme de fit (d’interpolation des données) qui permette de modéliser les différents paramètres liés à la méthode et à la réaction cinétique enzymatique de manière simultanée. Dans ce sens, Allouche-Arnon et al. montrent qu’il est possible de quantifier une succession de réactions enzymatiques de premier ordre catalysées par la même enzyme dont le substrat intermédiaire s’isomérise.116 Une autre méthode de quantification des vitesses de transformation enzymatiques a été réalisée par E. Miclet et al.117 L’étude de la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate via l’hexokinase, qui est l’étape commune à plusieurs voies métaboliques a montré que les deux anomères de glucoses se transformaient respectivement en leurs anomères respectifs de G6P avec des vitesses similaires.117 Ces deux travaux montrent qu’il est difficile de quantifier l’ensemble des points obtenus en raison du problème de mélange lié à l’injection qui fausse la concentration des métabolites détectés.
L’objectif de cette thèse est de quantifier les composantes de la cascade enzymatique de la partie oxydative sur la voie des pentoses phosphates. Ce système enzymatique complexe est une cible thérapeutique de choix en raison de l’importance physiologique de chaque enzyme pour la cellule. Pour ce faire, les cinétiques des transformations catalysées par chaque enzyme seront quantifiées d’abord séparément, puis de manière simultanée, in vitro, par D-DNP. Par la suite, des tests d’inhibitions seront réalisés pour connaitre l’influence des inhibiteurs sur la voie oxydative. Des tests in vivo seront ensuite réalisés pour observer l’influence de ces inhibiteurs sur l’ensemble des processus cellulaires.

La polarisation dynamique nucléaire suivie par dissolution, D- DNP :

Les techniques de polarisation dynamique nucléaire suivie par dissolution de l’échantillon (Dissolution-DNP ou D-DNP, pour « Dissolution Dynamic Nuclear Polarization ») a été développée pour augmenter la sensibilité de la RMN. La D-DNP permet d’amplifier, à basse température (celle de l’hélium liquide), la polarisation de noyaux d’intérêt puis d’effectuer la détection de ces noyaux après dissolution et transfert dans un site de détection (spectromètre ou imageur), à température ambiante. Le transfert de polarisation des spins électroniques, qui sont hautement ordonnés à T = 1 K, vers les spins nucléaires permet d’augmenter le signal RMN d’un facteur important, ɛ = Shyperpolarisé / Snon-hyperpolarisé > 10 000. La D-DNP a été développée par l’équipe de Jan Adenkjaer-Larsen à Malmö5.
Depuis 2003, de nombreuses équipes de recherche développent des méthodes pour étendre le champ d’application de la D-DNP à différents domaines, allant de l’étude de cinétiques de réactions chimiques115,116 aux applications de la spectroscopie in vivo.9,8,125,126 L’une des plus belles avancées a été la première observation d’une tumeur se trouvant sur la prostate d’un patient par IRM. Après l’injection intraveineuse de pyruvate hyperpolarisé, la transformation du pyruvate en lactate, dont la cinétique rapide est le marqueur d’une tumeur prostatique, est observée en temps réel. Ces résultats montrent que la D-DNP peut devenir un nouvel outil diagnostique.10
Depuis l’introduction du transfert de polarisation des électrons vers les noyaux (iii) pour la spectroscopie RMN haute-résolution à l’état solide109 et liquide5 les groupes de recherche de l’EPFL et de l’ENS Paris ont démontré une série d’applications et des améliorations de la méthode.
Le premier développement envisagé à Lausanne, utilisant le système développé dans le département de physique127, concernait la conservation de la polarisation obtenue suite au transfert des spins électroniques et suite à la dissolution dans des états propres des spins nucléaires ayant des longs temps de vie.128 Des recherches sur la conservation optimale de l’hyperpolarisation ont été continuées en utilisant des hétéronoyaux tels que l’azote-15129 ou les protons.130 L’utilité du surplus de polarisation pour l’observation des noyaux avec des faibles constantes gyromagnétiques a été mise en évidence par l’étude de l’yttrium dans des complexe de type DOTA.131,132 La D-DNP utilisée en conjonction avec la relaxométrie a permis d’améliorer la sensibilité pour les mesures de relaxation à bas champs.133 La recherche de longs temps de vie a continué à des champs intermédiaires entre le polariseur et l’aimant de détection, ainsi que utilisant des cohérences a longs temps de vie, en présence des radicaux libres ou lorsque ces derniers sont éliminés par des réactions chimiques.
La polarisation croisée137,138 a permis d’améliorer la sensibilité de mesure par RMN des signaux des hétéronoyaux tels que le carbone-13 tout en utilisant des temps relativement courts de polarisation, proportionnels aux constantes de temps de relaxation des hydrogènes à basse température.
Une étape importante pour l’amélioration du signal obtenu a été la modulation en fréquence du rayonnement micro-onde appliquée aux spins électroniques, de manière à mieux couvrir les lignes spectrales larges des électrons à basse température.139
A ce point, l’étude des cinétiques enzymatiques par D-DNP a déjà été envisagée dans le groupe. L’amélioration du signal hyperpolarisé a continué via l’utilisation des radicaux libres incorporés dans une matrice140 qui ne se retrouvait plus dans la solution finale analysée, étant filtres lors de la dissolution.
Les applications biomédicales comptent l’étude de l’échange entre l’état libre d’un ligand et son interaction avec une protéine141 ainsi que des substrats ayant des protons équivalents chimiquement, qui conservent mieux l’hyperpolarisation dans des états à longs temps de vie, avant la transformation enzymatique.141 Les bénéfices de la protection du substrat polarise des faibles champs magnétiques, où la relaxation est accentuée, via l’utilisation d’un tunnel magnétique ont été démontrés.142
La polarisation d’un spin peut être détectée via le rapport entre les intensités des lignes dues à l’éclatement engendré par le J-coupling à la fréquence de son voisin, comme démontré par une étude récente.143
Pour les études de métabolique, la D-DNP offrait le potentiel d’une amélioration de la sensibilité qui était hautement nécessaire pour les mesures dans les milieux complexes, pourvu que ces mesures restent reproductibles. Ce potentiel de la D-DNP pour la métabolomique a été valorisé dans la publication de 2016.111
Les temps de vie courts de l’hyperpolarisation restaient l’obstacle principal pour les applications de la D-DNP pour les analyses par RMN ou pour le diagnostic par RMN. L’avancée avec le plus grand écho a été l’obtention des métabolites transportables avec des temps de vie de l’aimantation pouvant atteindre des dizaines d’heures.144
La capacité de la D-DNP de peupler des états propres des spins nucléaires qui seraient autrement difficilement observables a été utilisée a l’ENS pour observer un état appartenant à la fois aux spins 2H et 13C des groupes méthyl qui possèdent des longs temps de vie.145 Les longs temps de vie des groupements méthyl ont été utilisés pour la DNP dans le cadre d’une collaboration entre Lausanne, ENS Paris et Southampton.146
La relaxation électronique peut varier en fonction de la fréquence de l’électron. Les effets de l’anisotropie de la relaxation électronique sur la D-DNP ont été étudiés à l’ENS.147

Instrumentation

L’instrumentation permettant la réalisation des expériences D-DNP comprend trois éléments principaux:
1. Un polariseur, composé d’un aimant et d’un cryostat qui contient de l’hélium liquide dont la température peut être maintenue à T = 1,2 K grâce à un système de pompage qui maintient une faible pression dans le cryostat. Une source micro-onde permet d’irradier les électrons libres (de radicaux stables) présents dans les radicaux stables utilisés pour le processus de polarisation dynamique.
2. Une canne de dissolution permet de transférer de l’eau à ~ 180 °C et à haute pression (typiquement 10 bar) pour dissoudre l’échantillon « hyperpolarisé ». La solution est ensuite envoyée vers l’aimant de détection (spectromètre RMN liquide, IRM). Au cours de cette étape, B0polariseur la solution « hyperpolarisée » circule dans un tunnel magnétique, qui permet de limiter la perte de polarisation lors du transfert entre le polariseur et le site de détection.

Injection et détection

La solution hyperpolarisée est transférée vers le champ magnétique de détection (B0 = 9,4 T pour les expériences décrites dans ce travail) à l’aide d’un injecteur situé dans l’ouverture de l’aimant (voir figures). Le démarrage de la séquence d’impulsions est synchronisé avec le début du mouvement du piston permettant l’injection de la solution.
Une série de spectres 1D successifs est effectuée à l’aide d’impulsions de lecture de petit angle (de l’ordre de 10°) afin de préserver l’aimantation et de pouvoir observer le signal sur une durée de l’ordre de quelques T1 (en l’absence de réaction consommant le substrat). Les spectres sont typiquement acquis toutes les secondes, sachant que l’intervalle entre deux spectres successifs est limité par la durée de l’acquisition. Pour simplifier les spectres et augmenter la qualité du signal sur les espèces doublement enrichies en 13C et 2H, un découplage du deutérium est appliqué pendant la durée de l’acquisition. Dans certains cas, un découplage 1H est également utilisé (cf infra).
La relaxation désigne l’ensemble des mécanismes qui font que l’aimantation d’un échantillon retourne à sa valeur d’équilibre thermique caractéristique pour le champ magnétique B0 dans lequel il se trouve, suite à une perturbation. Les sources de relaxation sont multiples, et elle peut dans le cas des expériences de DNP s’avérer délétère.
De manière générale, la relaxation provient de l’existence de fluctuations rapides au cours du temps des interactions magnétiques entre spins (nucléaires ou électroniques), et dues à la mobilité des molécules. Dans le cas de spins ½, il s’agit d’interactions dipôle-dipôle, de l’anisotropie de déplacement chimique (CSA) et des interactions entre spins électronique et nucléaire (dipolaire ou hyperfine).
En solution, ces interactions peuvent être modulées par des mouvements de rotation (interaction intra-moléculaire) ou de translation lorsque les spins concernés appartiennent à des molécules différentes. Dans le contexte de la DNP par dissolution, la présence de radicaux dans la solution représente un facteur potentiellement « aggravant » de la relaxation.
La vitesse de relaxation longitudinale du spin I par interaction dipolaire avec le spin S est de la forme : R1 = K2[j( I- S) +3j( I)+6j( I + S)], où K est une constante et j( ) est la fonction de densité spectrale, toutes deux dépendant du mécanisme de relaxation. Dans le cas où les deux spins appartiennent à la même molécule, K = ( 0* I* S*h)/(8 2<r3>)(µ0 est la perméabilité du vide (4π.10-7 H.m-1), τc est le temps de corrélation rotationnelle, I et S sont respectivement les constantes gyromagnétiques d’un spin I et d’un spin S) et j( ) est la fonction de densité spectrale de rotation. Lorsque la fonction de corrélation de diffusion rotationnelle est exponentielle, on a j( ) = τc /(1+( τc)2), et τc est le temps de corrélation de rotation.
Pour une diffusion rotationnelle (qui décrit la relaxation paramagnétique dans le cas d’une solution), les expressions de K et de j( )155,156 montrent notamment que lorsque l’échantillon se trouve dans une région où le champ magnétique est très faible, la contribution paramagnétique est particulièrement importante. De plus, dans le cas de la relaxation paramagnétique, K est proportionnel (entre autres) à la concentration de radical dans la solution. Ces facteurs sont donc importants dans le contexte des expériences que nous présenterons dans ce travail.

Applications de la D-DNP aux réactions enzymatiques :

Dans le but d’observer les cascades enzymatiques de la voie oxydative de la PPP, le [U-13C6-D7]-glucose, le [13C1-D1]-glucose ou le [U-13C6-D7]-glucose-6-phosphate ont été congelés et introduits dans le polariseur pour être hyperpolarisés. Des substrats doublement marqués 2H, 13C ont été utilisés afin de diminuer la relaxation des noyaux 13C.116 Le sucre a ensuite été dissout dans du D2O à l’aide de la canne de dissolution et transféré via le tunnel magnétique dans l’aimant d’observation contenant les enzymes, les co-facteurs et le tampon. Toutes les secondes, les signaux du sucre injecté et des différents métabolites intermédiaires sont détectés.

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE 1 : LA VOIE DES PENTOSES PHOSPHATES
1.1 INTRODUCTION
1.2 DECOUVERTE DE LA VOIE DES PENTOSES PHOSPHATES (PPP) :
1.3 L’ETAPE OXYDATIVE DE LA VOIE DES PENTOSES PHOSPHATES :
1.3.1 LA GLUCOSE-6-PHOSPHATE DESHYDROGENASE, LA G6PD :
1.3.2 LA 6-PHOSPHOGLUCONOLACTONASE, LA 6PGL : LA 6PGL CHEZ L’HOMME
1.4 MALADIES INFECTIEUSES LIEES A LA PPP :
1.4.1 PARASITOSES
1.4.2 MALADIES PROVOQUEES PAR LES BACTERIES :
1.5 METHODES ANALYTIQUES POUR CARACTERISER LA PPP :
CHAPITRE 2 : DE LA RMN A LA D-DNP
2.1 PRINCIPES GENERAUX DE LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE, LA RMN
2.2 LA POLARISATION DYNAMIQUE NUCLEAIRE SUIVIE PAR DISSOLUTION, D-DNP
2.2.1 INSTRUMENTATION
2.2.2 EXPERIENCE D-DNP
2.2.3 APPLICATIONS DE LA D-DNP AUX REACTIONS ENZYMATIQUES :
CHAPITRE 3: ETUDE DE LA PREMIERE ENZYME DE L’ETAPE OXYDATIVE DE LA VOIE DES PPP, LA GLUCOSE-6-PHOSPHATE DESHYDROGENASE, LA G6PD :
3.1 EXPERIENCES PRELIMINAIRES POUR L’ETUDE DE LA G6PD :
3.2 ETUDE DE LA G6PDH DANS UN TUBE DE 10 MM DE DIAMETRE :
3.2.1 EXTRACTION DES PARAMETRES CINETIQUES DU CYCLE DES « LACTONES »
3.2.2 EXTRACTION DES PARAMETRES CINETIQUES DE L’HK ET DE LA G6PD
3.3 ETUDE DE LA G6PD A PARTIR DU [U-13C-D7] G6P PAR D-DNP
3.3.1 SYNTHESE ET PURIFICATION DU [U-13C-D7]-G6P
3.3.2 ETUDE DE LA G6PD A PARTIR DU [U-13C-D7]-G6P PAR D-DNP
CHAPITRE 4 : ETUDE DE LA 6-PHOSPHOGLUCONOLACTONASE (6PGL), DEUXIEME ENZYME DE L’ETAPE OXYDATIVE DE LA PPP :
4.1 ETUDE CINETIQUE DE LA TB-6PGL PAR D-DNP
4.1.1 ETUDE CINETIQUE DE LA TB-6PGL A PARTIR DU GLUCOSE
4.1.2 ETUDE DE LA 6PGL A PARTIR DU [13C-D7]-G6P
4.1.2.2 CASCADE ENZYMATIQUE AVEC 240 G DE TB-6PGL (EXPERIENCE B)
4.1.2.3 ANALYSES DES CINETIQUES DES CASCADES ENZYMATIQUE G6PDH – TB-6PGL (EXPERIENCE A ET B)
4.2 INHIBITION DE LA 6PGL
4.2.1 LA METHODE
4.2.2 RESULTATS
4.2.3 DETERMINATION DE L’IC50
4.2.4 INHIBITION DE LA 6PGD
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

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