Soutenance mémoire
Principes de la méthodologie FAIRE
La tavelure du pommier
La tavelure est une des principales affections fongiques du pommier. La maladie tue rarement son hôte mais a un impact économique important, du fait qu’elle peut réduire significativement (jusqu’à 100 %) la qualité et la production des fruits et les rend impropres à la commercialisation. Elle est causée par un champignon ascomycète nommé Venturia inaequalis et est rencontrée dans le monde entier. Les pommiers affectés présentent des lésions noires ou brunes à la surface des feuilles, des bourgeons ou des fruits et parfois même sur le bois. Ces symptômes sont illustrés dans la figure 1 ci-contre. Un climat humide au moment du débourrement permet une grande diffusion des spores du champignon et favorise la maladie.
Une infection primaire par les ascospores peut conduire à la production d’inoculum secondaire sous forme de conidies qui seront à l’origine de contaminations secondaires. La protection phytosanitaire vis-à-vis de la tavelure peut représenter jusqu’à 50% des traitements en verger (CTIFL, 2002). C’est pourquoi cette maladie a été ciblée par l’équipe Respom pour observer l’efficacité de protection des SDP en verger.
SDP
Le mode d’action des SDP est d’induire des réactions de défense chez le végétal, incluant notamment la production de molécules de différentes natures, toxiques pour les bioagresseurs ou freinant leur progression. Ces intrants peuvent être synthétiques ou d’origine naturelle (plantes, animaux, microorganismes). Ils n’ont pas d’action directe sur les bioagresseurs, et sont considérés comme plus respectueux de l’environnement (Benhamou & Rey, 2012). Ils sont cependant régis par la même réglementation que les produits phytopharmaceutiques (directive 91/414/CEE) et font face aux procédures d’homologation et d’AMM longues et coûteuses qui freinent le développement de leur utilisation.Un SDP doit en théorie respecter trois conditions pour être considéré comme tel: ne pas avoir d’activité antimicrobienne directe, permettre une protection contre un large spectre d’agents pathogènes (sans spécificité) et activer les mécanismes de défenses de la plante (Globowski, 2008). Si les SDP démontrent une efficacité de protection en conditions contrôlées, ils sont généralement reconnus pour n’avoir qu’une efficacité partielle et souvent aléatoire au champ. Cette efficacité est parfois suffisante pour réduire les traitements phytosanitaires classiques, mais trop faible pour les remplacer complètement (Beckers & Conrath, 2007).L’intérêt technique et environnemental de ces produits incite à plus de recherches pour l’optimisation de leur utilisation.Parmi les SDP étudiés au laboratoire, le SDP X a démontré une efficacité de protection significative pour lutter contre la tavelure sur des semis et scions de pommier en serre.L’efficacité de protection contre la tavelure en verger a également été observée mais doit être confirmée (Brisset, Communication personnelle).
Induction de défenses
Face aux multiples bioagresseurs, les plantes disposent de mécanismes de défenses variés. Elles ont des défenses constitutives, qui sont présentes en permanence (comme la cuticule et la paroi cellulaire), et des défenses induites qui se déclenchent lorsque les bioagresseurs parviennent à franchir ces premières. Les plantes sont capables de percevoir la majorité des bioagresseurs et répondent par des mécanismes de défenses locales pour éviter le développement de la maladie. Cette réponse se traduit souvent par une mort des cellules au point d’infection, caractéristique de ce qui est qualifiée de réaction d’hypersensibilité (HR). Pour se protéger des agressions futures, les plantes peuvent aussi induire les défenses dans les parties non infectées. Il s’agit de la résistance systémique acquise (SAR). La reconnaissance des bioagresseurs déclenche une émission de signaux d’alerte dans l’ensemble de la plante grâce à une cascade de réactions impliquant différentes voies de signalisation, notamment les voies de signalisation de l’acide salicylique, de l’acide jasmonique et de l’éthylène. L’induction de ces voies de signalisation aboutit à la synthèse de composés à action biocide (comme les « Pathogenesis-Related » protéines ou PR protéines, les phytoalexines,…) ou impliqués dans le renforcement pariétal. La perception des attaques des agents pathogènes biotrophes est plus généralement caractérisée par l’activation en aval de défenses SA-dépendantes, tandis que la détection de stress biotiques comme les attaques d’insectes herbivores ou agents pathogènes necrotrophes, ou abiotiques comme des blessures quelconques, est plutôt associée à l’activation de défenses JA dépendantes (Thaler et al, 2012).
La voie SA-dépendante commence par la synthèse de l’acide salicylique à partir de protéines précurseurs comme EDS1 (Wiermer et al., 2005). L’accumulation locale et systémique d’acide salicylique est corrélée à l’induction précoce des gènes de facteurs de transcription WRKY qui jouent un rôle important dans la régulation de l’immunité des plantes. La voie JA dépendante débute par la synthèse de l’acide jasmonique à partir d’oxydation des phospholipides membranaires par des lipoxygénases (LOX) (Devoto & Turner, 2005). L’éthylène est reconnu comme un modulateur indispensable de certaines voies, et notamment celle de l’acide jasmonique. Son précurseur principal est la S-adénosine-L-méthionine qui dérive du métabolisme de synthèse des acides aminés soufrés (méthionine, homocystéine et cystéine) (Bleecker et al., 2000 ; Ma et al., 2006).
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Purification d’ADN |
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Table des matières
1. Introduction
2. Etude bibliographique
2.1. La tavelure du pommier
2.2. SDP
2.3. Induction de défenses
2.4. Potentialisation
2.5. Modifications épigénétiques dans la potentialisation
2.6. Principes de la méthodologie FAIRE
3. Matériels et méthodes
3.1. Matériels
3.1.1. Matériel végétal
3.1.1.1. En conditions semi-contrôlées
3.1.1.2. Le verger
3.1.2. Les SDP et le peroxyde dhydrogène
3.2. Méthodes
3.2.1. Analyses moléculaires
3.2.1.1. Prélèvements
3.2.1.2. Analyse transcriptionnelle
a) Extraction dARN et RT
b) qPCR
3.2.1.3. Analyse FAIRE-PCR
a) Infiltration
b) Vérification de lefficacité de linfiltration
c) Sonication
d) Vérification de lefficacité de la sonication
e) Extraction dADN
f) PCR
3.2.2. Analyse de protection en verger
a) Les modalités
b) Observation de la tavelure
c) Outils danalyse statistique
4. Résultats
4.1. Mise au point de la méthodologie FAIRE sur feuilles de pommier
4.1.1. Concentration de formaldéhyde
4.1.2. Conditions de sonication
4.2. Mise au point des conditions dutilisation des amorces pour lanalyse PCR des
promoteurs de gènes de défense.
4.3. Validation de la méthodologie FAIRE-PCR
4.4. Sélection des échantillons potentialisés
4.5. FAIRE-PCR sur échantillons potentialisés
4.6. Effets de protection en verger
5. Discussion
5.1. Corrélation entre modifications épigénétiques et potentialisation
5.2. Critique de la démarche suivie
5.2.1. Gènes de référence
5.2.2. Purification dADN
5.2.3. Limites de la PCR
5.3. Relation entre induction de gènes de défense et efficacité de protection
6. Conclusion
Bibliographie….
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