Soutenance mémoire
PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DES LENTIVIRUS DE PRIMATES
La particule lentivirale
Sur le plan morphologique, les virus du SIDA des primates sont très proches des autres lentivirus. La membrane virale, dans laquelle est ancrée les tétramères de protéines d’enveloppe, enserre un core de structure conique. Ce core, très dense aux électrons en microscopie électronique, est principalement composé de protéines gag, p24 et contient deux molécules d’ARN simple brin et les différentes enzymes virales (transcriptase inverse, protéase et intégrase). D’autres protéines virales sont également localisées dans le virion : les protéines p18, p7 et p9 de la région gag, ainsi que la protéine vpr.
Le génome des lentivirus
Les lentivirus sont, au niveau génétique, les plus complexes des rétrovirus décrits à ce jour (45, 74). En effet, outre les trois phases de lecture ouvertes codant pour les protéines de structure des rétrovirus (gag, pol et env), on observe des phases ouvertes de lecture de petite taille réparties surtout entre les gènes pol et env, mais également à l’extrémité 3’ du génome. Le génome du VIH-1 est composé de neuf phases ouvertes de lecture codant pour les protéines gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env et nef, encadrées par deux séquences non codantes répétées : les LTR (Long Terminal Repeat). Le génome du VIH-2 est très proche de celui du VIH-1, il montre cependant une différence notable dans son organisation génétique. Ce virus ne possède pas de gène vpu tandis qu’une séquence, sans homologie avec le VIH-1, code pour la protéine vpx (135, 145, 330). La phase ouverte de lecture des gènes gag code pour les quatre protéines structurales du core : p18, p24, p7, p9 tandis que trois protéines sont codées par la phase de lecture du gène pol : transcriptase inverse, protéase et intégrase. Le rôle de certaines protéines de la région centrale : vif, vpr, vpx et vpu n’est pas clairement établi, il semble qu’elles ne soient pas indispensables à l’infectivité in vitro, cependant, leur action in vivo semble primordiale. Il en va de même pour la protéine nef qui, in vitro, ne semble pas influencer la réplication virale, mais qui est nécessaire au développement d’un Sida chez le macaque (172). Les deux protéines tat et rev ont été particulièrement étudiées. Tat est une protéine nucléaire indispensable à l’élongation de la transcription du VIH. Cette protéine se fixe sur une séquence d’ARN dans le LTR (TAR) (139, 231) qui, par sa structure en épingle à cheveux, bloquerait l’élongation (301). Tat est donc un amplificateur de l’expression des protéines virales agissant par feed back positif. Le rôle de la protéine rev est complémentaire de l’action tat. Cette nucléoprotéine permet le transport vers le cytoplasme des ARN messagers peu ou pas épissés (102, 213). Rev dirige donc non seulement l’expression des protéines de structures gag, pol et env mais aussi certaines protéines régulatrices (tat, vif et vpr). Par contre, rev a un effet néfaste sur sa propre production. Le mécanisme de rétention nucléaire des messagers non épissés n’est pas encore parfaitement éclairci, cependant, la protéine rev agit par fixation sur une région de la phase ouverte codant pour env (RRE) (137, 214). Parmi les VIH et les SIV, les phases ouvertes de lecture des gènes vpu et vpx sont différemment identifiées. Ainsi, le SIVmac (51) et le SIVsm (151) ont la même structure génétique que le VIH-2 (vpu-, vpx+) tandis que le SIVagm (111) et le SIVmnd (322) sont doublement négatifs (vpx-, vpu-). Contrairement aux autres SIV, le SIVcpz infectant naturellement le chimpanzé a une structure génétique identique à celle du VIH-1 (vpu+, vpx-) (159). Lors du séquençage du SIVcpz, son homologie avec le groupe des VIH-1 ne fit aucun doute, cependant, une grande divergence génétique fut observée dans la région du vpu. En effet, la protéine du SIVcpz n’a aucune homologie avec celle des VIH-1 à l’exception d’un dodécapeptide dans la partie centrale. Cette homologie, qui permet sans doute d’identifier la région fonctionnelle de vpu, ainsi que les profils d’hydrophobicité de deux protéines, rendent probable l’identité fonctionnelle du vpu du SIVcpz et celui des VIH-1. En ce qui concerne les autres protéines de « régulation » (tat, rev, vpr, vif et nef), ils sont retrouvés chez tous les lentivirus de primates connus à ce jour.
Les cellules cibles
La sélectivité des tropismes du VIH et la sévérité du déficit immunitaire induit par l’infection sont en grande partie liées à l’interaction spécifique entre la glycoprotéine du VIH, la gp120 et la molécule CD4 récepteur de haute affinité au VIH (177). La molécule CD4 est une protéine membranaire exprimée en forte quantité à la surface des lymphocytes T auxiliaires. Le récepteur CD4 est également exprimé bien qu’à un moindre degré, sur les cellules présentatrices d’antigène : monocytes et macrophages, cellules dendritiques et de Langerhans et sur la microglie dans le cerveau. Les cellules folliculaires dendritiques (FDC) quant à elles fixent le VIH à leur surface, mais sans internaliser le virus. Le VIH, par son tropisme pour le récepteur CD4, infecte ainsi les cellules centrales du système immunitaire et peut infiltrer la totalité des tissus humains.
Les récepteurs cellulaires
Si la molécule CD4 fonctionne comme un récepteur de haute affinité pour la gp120 des VIH/SIV, des récepteurs accessoires sont nécessaires à la pénétration du virus dans la cellule hôte. Plusieurs co-récepteurs, notamment CCR5 et CXCR4, ont été au terme de longues années de recherches. Les co-récepteurs CCR5 et CXCR4 utilisés par le VIH sont des récepteurs de chimiokines (1, 197). Ces chimiorécepteurs sont exprimés sur les lymphocytes CD4+ et les macrophages et coopèrent avec la molécule CD4 pour permettre l’entrée du virus dans la cellule.
Le cycle réplicatif des lentivirus
Comme celui de tous les rétrovirus, le cycle réplicatif des lentivirus simiens se déroule en quatre étapes après la fixation:
– l’entrée du virus
– la rétrotranscription du génome viral en ADN complémentaire suivie de son intégration dans le génome cellulaire,
– l’expression des gènes viraux en protéines virales,
– et enfin l’encapsidation des nouveaux virions suivie de leur maturation et de leur libération par bourgeonnement ( 70).
L’entrée du virus se fait après attachement à un récepteur cellulaire. Le récepteur de haute affinité des lentivirus de primates est la molécule CD4, reconnue par la glycoprotéine de surface, la gp120 (177). Plusieurs évènements apparaissent nécessaires à l’entrée du virus dans la cellule cible. Ainsi la fixation de la gp120 du VIH-1 à la molécule CD4 est suivie d’un changement de conformation de la glycoprotéine virale permettant un clivage au sein de cette molécule (62, 218). C’est dans ce complexe nucléoprotéique que le génome viral est rétrotranscrit en ADN double brin grâce à la transcriptase inverse et à une amorce (tRNA-lys) contenues dans la nucléocapside. Après transport du complexe viral vers le noyau, l’ADN s’intègre dans le génome cellulaire grâce à l’intégrase virale. La rétrotranscription complète et l’intégration de l’ADN viral dépendent de l’état d’activation de la cellule cible (282). Les protéines virales de structures s’associent aux nouvelles molécules d’ARN viral synthétisées. Ce sont notamment les protéines gag qui se fixent à l’ARN et assurent la dimérisation de l’ARN viral, son encapsidation, puis la liaison entre le capside et la membrane virale (70). Les particules virales quittent la cellule par bourgeonnement. Au moment du bourgeonnement, il ne s’agit que de particules immatures qui achèvent leur maturation au stade de virions libérés. D’autres protéines régulatrices tels que Rev/Rex ou Tat/Tax/Taf peuvent être impliquées dans le cycle réplicatif des rétrovirus. Le rôle de ces protéines accessoires commence à être bien connu pour les lentivirus de primates. La protéine Vif des lentivirus est exprimée de manière Rev-dépendante à partir d’un ARN messager mono-épissé (292). Elle est présente dans le cytoplasme des cellules infectées et augmente l’infectivité du virus (309). La protéine Vif du VIH-1 semble participer dans l’achèvement de la rétrotranscription de l’ARN viral après l’entrée du virus et dans la maturation des glycoprotéines au moment de la formation des virions (311). La protéine nef est exprimée de façon précoce dans la cellule infectée. Elle est localisée dans le cytoplasme, la membrane interne et dans le noyau (110, 166, 211). Nef a été initialement décrit comme une protéine ayant un effet négatif sur la réplication virale en culture (205). Elle pourrait induire des facteurs de régulation négatifs agissant sur le NRE du LTR. L’effet négatif de Nef sur la réplication virale n’est cependant pas observé pour tous les virus et tous les types de cellules étudiées. Elle est capable aussi de diminuer l’expression de molécules CD4 à la surface de certaines lignées cellulaires (117). In vivo, la protéine Nef de SIVmac est essentielle pour l’établissement d’une infection persistante et pathogène chez le macaque .
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Table des matières
INTRODUCTION
1ère PARTIE : GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUS DES PRIMATES
I. PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DES LENTIVIRUS DE PRIMATES
1.1. La particule lentivirale
1.2. Le génome des lentivirus
1.3. Les cellules cibles
1.4. Les récepteurs cellulaires
1.5. Le cycle réplicatif des lentivirus
II. HISTOIRE NATURELLE DE L’INFECTION VIH
2.1. Évolution de l’infection par le VIH
2.1.1. La primo-infection
2.1.2. La phase asymptomatique
2.1.3. La phase symptomatique
2.2. Aspects physiopathologiques de l’infection VIH
2.2.1. Mécanismes impliqués dans l’évolution vers le SIDA
2.2.1.1.Tropisme et récepteurs du VIH
2.2.1.2. La dissémination du virus et infection précoce
2.2.2. La charge virale et la destruction des tissus lymphoïdes
2.2.3. La déplétion en cellules T CD4+
2.2.4. Les anomalies de régénération des lymphocytes T CD4+
2.2.5. La dynamique de l’activation
2.3. Réponses immunes lors de l’infection par le VIH
2.3.1. Réponses humorales
2.3.2. Réponses cellulaires
2.3.2.1. Les réponses TCD4+ et T CD8+
2.3.2.2. La réponse NK
2.3.2.3. Cytokines et réplications des lentivirus
2.3.2.4. La Réponse suppressive
III. LES MODELES SIMIENS D’INFECTION LENTIVIRALE
3.1. Les modèles simiens d’infection pathogène
3.1.1. Le modèle macaque
3.1.2. Autres modèles pathogènes
3.2. Les modèles simiens d’infection non pathogène
3.2.1. Le modèle singe vert d’Afrique
3.2.2. Autres infections non pathogènes ches les singes d’Afrique
2ème PARTIE: TRAVAIL EXPERIMENTAL
I. OBJECTIFS
II. MATERIEL ET METHODES
2.1. Matériel
2.1.1. Matériel biologique
2.1.1.1. Singes verts d’Afrique
2.1.1.2. Cellules
2.1.1.3. Virus
2.1.1.4. Bactéries et protéines
2.1.2. Réactifs et Tampons
2.1.2.1.Réactifs
2.1.2.2. Tampons
2.2.Techniques de Culture cellulaire
2.2.1. Congélation
2.2.2. Décongélation
2.2.3. Culture directe de PBMC
2.2.4. Co-culture avec des PBMCs ou des lignées
2.2.5. Isolement et propagation des SIV
2.2.5.1. Culture directe
2.2.5.2. Co-culture avec des cellules de lignées
2.3.Techniques sérologiques
2.3.1. Elisa SIV : Dosage de l’antigène
2.3.2. Elisa BCG
2.4. Méthodes de mesure de la prolifération cellulaire in vitro
2.4.1. Marquage par thymidine tritiée
2.4.2. Principe de la cytométrie en flux
2.4.3. Protocole de suivi de prolifération de PBMCs, par marquage avec une sonde fluorescente, le PKH26
2.5. Méthodes de mesure des cytokines
2.5.1. Mesure de Cytokines intracellulaire par cytométrie en flux
2.5.2. Dosage des Cytokines Plasmatiques
III. RESULTATS
3.1. Choix des animaux
3.2.Mises au point des techniques : Approche expérimentale
3.2.1. Doses-réponses
3.2.2. Nombre de cellules
3.2.3. Durée d’incubation
3.3.Stimulation antigénique
3.4.Suivi des lymphocytes dans le sang total
3.5.Suivi des Monocytes dans le sang total
3.6.Cinétique des réponses immunes cellulaires
3.6.1 Marquage direct sur le sang total
3.6.2. Cinétique des CD3+
3.6.3. Suivi des lymphocytes CD4+
3.6.4. Suivi des lymphocytes CD8+
3.6.5. Suivi des lymphocytes CD20+
3.7.Mesure de la prolifération cellulaire in vitro par le PKH26
3.8.Cinétiques des réponses immunes humorales
3.9.Dosage des cytokines plasmatiques
3.10. Dosage de la Protéine C Réactive
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
