Prévalence des mutations associées à la résistance à l’AQ et à la CQ 40

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Le mode de contamination.

Le paludisme est transmis à l’homme par la piqûre de l’anophèle femelle, infectée. La transmission peut également se faire à travers la barrière hémato-placentaire.

Les facteurs favorisants de la transmission (26).

La transmission du paludisme dépend de plusieurs facteurs dont les plus importants sont : la température; l’eau et l’humidité et les facteurs anthropiques (barrages et irrigations) ;

Le cycle du parasite (26).

Le cycle du parasite comporte trois stades dont deux se déroulent chez l’homme et un chez le moustique (Figure 3).

Diagnostic.

Le diagnostic du paludisme est aussi bien clinique que para clinique.

Diagnostic clinique (2, 3, 7 et 13).

Les manifestations cliniques du paludisme sont diverses. Elles dépendent aussi bien du parasite que de l’hôte. Il existe deux tableaux cliniques:
a. Les accès simples qui comprennent le paludisme de primo invasion et les accès de reviviscence schizogonique à fièvre périodique, communs à toutes les espèces plasmodiales
b. Les formes graves dont l’accès pernicieux (Neuropaludisme ou paludisme cérébral) dues essentiellement à P.falciparum (Tableau I).

La Chimioprophylaxie

• Le Traitement Préventif Intermittent (TPI):
Le TPI consiste à l’administration de médicaments antipaludiques à des doses thérapeutiques, à une population à risque (femmes enceintes, enfants), indépendamment du fait que la personne soit infectée ou non, dans l’objectif de prévenir la morbidité ou la mortalité (37, 39).
• La chimioprévention du paludisme saisonnier :
La CPS, autrefois appelée « traitement préventif intermittent du paludisme chez les enfants », est définie comme « l’administration intermittente d’un traitement complet par un médicament antipaludique pendant la saison de haute transmission du paludisme pour prévenir la maladie». L’objectif de cette stratégie est de maintenir des concentrations thérapeutiques de médicament antipaludique dans le sang pendant la période où le risque de contracter le paludisme est plus élevé. La stratégie de la CPS consiste à administrer un maximum de quatre cycles de traitement de SP + AQ à intervalles d’un mois à des enfants âgés de 3 à 59 mois dans les régions de forte transmission saisonnière du paludisme (31, 39).
• Chimioprophylaxie des expatriés et des voyageurs (39).
La prophylaxie médicamenteuse est indispensable pour les zones à P. falciparum. Elle n’est pas efficace à 100%. Elle doit être prise pendant tout le séjour et après le retour pendant une durée dépendant de l’antipaludique utilisé.

Les candidats vaccins antipaludiques :

Les candidats vaccins sont basés sur les divers antigènes issus des différents stades du cycle évolutif parasitaire. On peut distinguer :
– Le candidat vaccin anti-stade pré-érythrocytaire (RTS,S/AS01) (41),
– Le candidat vaccin anti-stade sanguin asexué : (vaccin MSP/RESA),
– Le candidat vaccin bloquant la transmission.
Les antigènes variant de surface exprimés par les parasites adhérents au placenta sont des candidats prometteurs pour une vaccination spécifique contre le paludisme de la femme enceinte.

La lutte anti-vectorielle (13).

Elle vise à éviter la transmission des parasites à la population par l’anophèle. Elle s’attaque au vecteur et aux différents stades de son développement. Pour cela, plusieurs méthodes sont utilisées :
 La lutte anti larvaire : (26).
Elle a pour objectif de réduire les populations d’anophèles à leur source. Elle comporte plusieurs méthodes qui se classent en trois catégories :
 L’aménagement de l’environnement par asséchement et drainage des eaux usées.
 La lutte biologique avec des poissons larvivores comme gambusies et guppies.
 La lutte chimique par l’utilisation de larvicides chimiques.
 Aspersions intra-domiciliaires (AID) d’insecticides à effet rémanent. L’AID est une méthode de lutte anti vectorielle (LAV) très sélective qui ne concerne que les populations de vecteurs endophiles. Le traitement est fait par aspersion/pulvérisation d’insecticide sur les surfaces intérieures des murs, plafonds ou toits des habitations et autres structures. L’effet insecticide persiste pendant une période variable (3 – 6 mois) et le traitement est fait avec un cycle variable selon la dynamique de la transmission du paludisme (13).
 Moustiquaires imprégnées d’insecticides (deltaméthrine, perméthrine):
C’est l’outil majeur de prévention du paludisme recommandée par l’OMS. Il est nécessaire de ré-imprégner régulièrement les moustiquaires pour maintenir leur efficacité. Actuellement, on utilise les moustiquaires imprégnées «longue durée» avec une rémanence de plusieurs années (55).
 Ports de vêtements imprégnés de perméthrine (utilisés par les armées) (55);
 Répulsifs (insecticides ou répellents) : deux produits sont recommandés en pratique : le DEET et le KBR 3023 (55).

RESISTANCES DE PLASMODIUM FALCIPARUM AUX ANTIPALUDIQUES

Définition de la résistance.

L’OMS a défini en 1967 la résistance comme étant la capacité du parasite à survivre et/ou à se multiplier en dépit de l’administration et de l’absorption d’un médicament donné à doses égales ou supérieures à celles habituellement recommandées mais dans les limites de la tolérance du malade (51). Il a été ajouté à cette définition en 1986 que la forme active du médicament devait pouvoir atteindre le parasite ou accéder à l’intérieur de l’érythrocyte infecté pendant la durée nécessaire à son action normale (1986 et 66(1):5-13.).
La résistance de P. falciparum aux antipaludiques constitue un obstacle majeur dans la lutte contre le paludisme (14, 29).

Emergence et propagation de la résistance.

Le développement de la résistance peut s’expliquer par la grande diversité génétique de P.falciparum due à un taux élevé de mutations dans son génome et par les masses très importantes de parasites portées par les individus infectés (53). Les mutations sont à l’origine de la grande variabilité génétique de P. falciparum, elles peuvent dans certains cas avantager sa survie en lui permettant par exemple d’échapper au système immunitaire de son hôte, de supporter la présence de molécules toxiques dans son environnement ou de se multiplier plus rapidement que d’autres clones (53). Les parasites mutants qui survivent en présence d’un antipaludique deviennent ainsi résistants et transmettent par la suite la mutation aux autres générations du parasite, générant ainsi une population capable de résister à une molécule (46, 53).

Les facteurs influençant le développement de la résistance

L’exposition des parasites à des concentrations de médicaments inférieures au seuil thérapeutique favorise davantage la sélection des parasites mutants résistants aux médicaments (49). Aussi, la propagation des nouvelles résistances émergeantes dépend de la recrudescence et de la transmission subséquente d’une infection ayant généré un nouveau parasite résistant (53). La production de gamétocytes à partir de l’infection recrudescente devrait être prévenue par l’administration précoce du traitement approprié. Il existe un intervalle de temps durant lequel le niveau du médicament avantage la survie du parasite résistant par rapport au parasite sensible (46). La propagation subséquente des parasites mutants est facilitée par l’administration des médicaments à longue durée d’action. L’activité antipaludique résiduelle présente après traitement sert de « filtre sélectif », prévenant seulement l’infection des parasites sensibles (53).
Le niveau de transmission du paludisme dans une zone influence également la propagation de la résistance du parasite aux antipaludiques (20).

Les autres facteurs favorisant l’émergence de résistances (47):

Il s’agit entre autre de :
• Une mauvaise utilisation des antipaludiques par les individus infectés conduisant à des traitements incomplets,
• Une indisponibilité des médicaments efficaces ou le déploiement inadéquat des médicaments sous forme de monothérapies.
• La consommation de contrefaçons sous dosées qui est un facteur permettant à des parasites viables de survivre à des concentrations sub-optimales d’antipaludiques et d’être sélectionnés pour leur aptitude à résister.

Surveillance de l’efficacité et de la résistance des antipaludiques.

L’OMS a fait des efforts considérables pour standardiser les méthodes d’évaluation d’efficacité de médicaments antipaludiques pendant les 40 dernières années, mais les recommandations les concernant ont changé plusieurs fois, en fonction de l’avis des experts de chaque époque et de l’avancée des connaissances. La méthode de référence de diagnostic et de surveillance des résistances est donc le test in vivo de l’OMS développé en 1965 et révisé en 1967, en 1972, en 1996 et enfin en 2007 (52). La confirmation de la résistance exige la preuve:
• Que les parasites sont recrudescents chez un patient qui a récemment reçu le traitement à dose adaptée et
• Que la concentration sanguine efficace du médicament ou de ses métabolites actifs a été maintenue pour au moins quatre cycles parasitaires (52).
Plusieurs méthodes de surveillance de la résistance aux antipaludiques sont utilisées :

Les tests d’efficacité thérapeutiques.

Ce sont des méthodes de référence standardisées par l’OMS (54), ces tests permettent d’évaluer l’efficacité clinique des schémas thérapeutiques recommandés pour traiter les accès palustres non compliqués. L’efficacité du principe actif est déduite à partir de la disparition de la parasitémie et de l’amélioration du tableau clinique du patient (54). Le suivi biologique et parasitologique, pendant 28 ou 42 jours, des patients traités permet de distinguer quatre types de réponse au traitement : l’échec thérapeutique précoce (ETP) (4), l’échec parasitologique tardif (EPT) (47), l’échec clinique tardif (ECT) (48), et une réponse clinique et parasitologique adéquate (RCPA) (30), qui caractérise un parasite sensible. Ces études cliniques sont généralement coordonnées avec des tests in vitro et moléculaires (54).

Les tests ex vivo et in vitro.

Ils consistent à mettre en culture, soit directement (test ex vivo), soit après adaptation en culture continue (test in vitro), un isolat sauvage de P. falciparum en présence d’une concentration croissante d’antipaludique (6). La mesure de la croissance des parasites (microscopique, isotopique, ELISA ou fluorimétrique) en fonction de la concentration en antipaludique permet de définir son niveau de sensibilité (6). Le résultat est évalué à partir de la concentration inhibitrice 50% (IC50), valeur correspondante à la concentration d’antipaludique permettant d’inhiber la croissance de 50% des parasites (par rapport au témoin sans drogue). Même si cette technique nécessite une logistique et un plateau technique de qualité, elle permet de tester plusieurs antipaludiques en parallèle et de se départir des facteurs liés à l’hôte (immunité, variation individuelle de la concentration sérique en antipaludique) (6).

Les marqueurs moléculaires de résistance.

Il s’agit d’un ensemble de marqueurs impliqués dans les mécanismes moléculaires de résistance. Ces marqueurs sont sensibles et spécifiques pour prédire le niveau de résistance d’un parasite aux antipaludiques, ils ont une place de choix dans la surveillance de l’activité de tel ou tel antipaludique. Il existe des marqueurs qui sont associés à un défaut d’accumulation des pharmacophores (partie d’une structure moléculaire qui est responsable d’une interaction biologique ou pharmacologique particulier qu’il subit) au niveau de la cible parasitaire, d’autres à une modification de la cible parasitaire. Les marqueurs moléculaires de résistance peuvent être étudiés sur une large échelle (à partir d’échantillons sanguins prélevés au bout du doigt et déposés sur papier filtre) et sont potentiellement automatisables. Il n’en existe que pour un nombre restreint d’antipaludiques. Les principaux marqueurs moléculaires utilisés dans la surveillance de l’efficacité de la combinaison SP+AQ sont:
• P.falciparum chloroquine transporter (Pfcrt).
Ce gène situé sur le chromosome 7 code pour un transporteur membranaire de la vacuole digestive. La mutation sur le codon 76 (K→T), associée à sept autres points de mutation (43, 50), permet au parasite de limiter l’accumulation de chloroquine dans sa vacuole digestive, où elle exerce son action inhibitrice (40). Pfcrt est également impliqué dans la baisse de sensibilité du parasite à l’Amodiaquine et à la quinine (10, 48). Dans les zones où les allèles de résistance ne sont pas fixés, on observe une augmentation de la fréquence de l’allèle sauvage après abandon de la chloroquine (23, 28). L’analyse de ce locus renseigne sur la pression médicamenteuse exercée au sein des populations.
• P.falciparum multi-drug resistance (Pfmdr).
Situé sur le chromosome 5, ce gène code pour un transporteur de type ABC (ATP binding cassette). La protéine Pfmdr-1 est impliquée dans la modulation de la sensibilité à de multiples antipaludiques et, plus particulièrement, dans l’efflux des antipaludiques hydrophobes (15). Les mécanismes de résistance sont liés: soit à des phénomènes de duplication, entraînant une augmentation de l’expression de la protéine (29) et la résistance aux aryl-amino-alcool (comme la Méfloquine ou la Luméfantrine) et une baisse de sensibilité aux dérivés de l’Artémisinine (mais sans lien statistiquement établi avec l’efficacité clinique des ACT (38); soit à l’apparition de mutations au niveau des codons 86 (N→Y), 184 (Y→F), 1034 (S→C), 1042 (N→D) et 1246 (D→Y), entraînant une altération de sensibilité des parasites à certains antipaludiques comme les amino-4-quinoléines (15). Il existe un effet antagoniste entre la sensibilité à la chloroquine et à la Méfloquine: la mutation 86Y diminue la sensibilité des parasites à la chloroquine, mais augmente celle de la Méfloquine. De même, l’augmentation du nombre de copies du gène (86N) augmente la résistance à la Méfloquine et à l’inverse accroît la sensibilité à la chloroquine.
• P.falciparum dihydrofolate reductase (Pfdhfr).
Ce gène, situé sur chromosome 4, code pour une enzyme intervenant dans la voie de synthèse des folates (20). Elle est la cible des médicaments anti-folates (Pyriméthamine, par exemple) qui, en inhibant son activité enzymatique, entraînent le blocage de la synthèse des pyrimidines et la réplication de l’ADN parasitaire (42). L’accumulation de plusieurs mutations spécifiques au sein de cette protéine (codons 50N→R, 51C→I, 108S→N et 164I→L) entraîne la résistance clinique des parasites à l’action des anti-folates.
• P.falciparum dihydropteroate synthétase (Pfdhps).
La dihydroptéroate synthétase est une autre enzyme intervenant dans la synthèse des folates (le gène correspondant est situé sur le chromosome 8). Elle est inhibée par les sulfamides. Les mutations se situant au niveau des codons 436 (S→A/F), 437 (K→G), 540 (K→E), 581 (A→G), 613 (A→S/T) confèrent une résistance à la Sulfadoxine (20).
L’analyse groupée des mutations au niveau des gènes Pfdhfr et Pfdhps permet de prévoir l’efficacité clinique de l’association Sulfadoxine Pyriméthamine, largement utilisée en Afrique chez la femme enceinte en traitement préventif (TPI : traitement préventif intermittent) ou en association avec l’Artésunate en traitement curatif (18), (Tableau III).

Type d’étude.

Il s’agit d’une étude transversale comparative avant-après qui a été faite à partir des enquêtes ménages où des prélèvements sanguins ont été réalisés afin de mesurer la prévalence palustre et de déterminer la prévalence des marqueurs moléculaires de résistance de P.falciparum à la SP et AQ dans les districts de Maka Colibantang, Saraya et Vélingara en 2013 et 2014.

Déroulement de l’étude.

Echantillonnage.

Nous avons effectué des enquêtes transversales avant et après la campagne d’administration de la CPS. Un échantillon d’adultes a été ajouté pour vérifier si les parasites résistants chez les enfants circulent aussi chez les sujets adultes.
Le calcul de la taille d’échantillon était basé sur une prévalence de parasitémie d’environ 5-10% au sud du Sénégal et des marqueurs de la résistance avec un intervalle de confiance de + ou – 10%. Le logiciel Epi Info nous avait donné une taille de l’échantillon de 500 et avec un effet de grappe de 2, à 1000 sujets à recruter avant et après la campagne CPS.

Description de l’étude

Les enquêtes ménage se sont déroulées dans des villages situés au sud du pays (régions de Kédougou, Kolda et Tambacounda : zones éligibles pour la mise en œuvre de la CPS). Les villages avaient été choisis sur la base d’une probabilité proportionnelle de la taille estimée. Au sein de chaque village sélectionné, les ménages à visiter avaient été choisis par un échantillonnage basé sur une carte du village. Dans chaque ménage, tous les enfants âgés de 3 à 120 mois, et toutes les personnes de 15 à 45 ans, résidant dans le ménage, ont été invités à participer. Pour chaque personne consentante (dans le cas des enfants dont le parent / tuteur y consent), un court questionnaire avait été administré afin d’enregistrer les identifiants personnels et l’âge, la date de naissance, sexe, date de l’interview, l’emplacement de la résidence, et autres détails. Un prélèvement sanguin était aussi effectué à la pulpe du doigt pour déterminer le taux d’hémoglobine et la confection d’une goutte épaisse et d’un papier filtre n°3 Whatmann A3. Tous les prélèvements confectionnés au cours de ces enquêtes de ménages avaient été ensuite acheminés au laboratoire de parasitologie et mycologie de l’UCAD pour les besoins d’analyses biologiques.

Travail au laboratoire.

La microscopie

Confection des lames de GE et Frottis sanguin.

 Goutte Epaisse
Une goutte de sang prélevée au niveau capillaire, d’environ 2µl, a été déposée au milieu d’une lame porte objet. A l’aide du coin d’une seconde lame, nous avons exécuté un mouvement en spiral afin de favoriser la défibrination et d’obtenir un étalement homogène de 5mm de diamètre. Nous avons ensuite laissé sécher à température ambiante.
 Frottis sanguin.
Une goutte de sang a été posée sur une première lame. Une seconde lame a été posée à environ 450 sur la première lame au niveau de la goutte de sang. Nous avons laissé le sang fuser le long du bord de la lame puis d’un geste rapide, nous l’avons étalé vers l’extrémité de la première lame.

Coloration et lecture de lames.

Les lames de frottis sanguin et goutte épaisse confectionnées, ont été stockés à température ambiante le temps des enquêtes ménages. Elles ont ensuite été lavées dans de l’eau Pierval, pH 7,2, avant d’être colorées avec une solution de Giemsa à 10% pendant 20 minutes. Après la coloration, nous avons effectué une lecture de la GE pour déterminer la densité parasitaire (DP) et du frottis pour en déterminer l’espèce. La microscopie a été utilisée pour détecter la présence ou l’absence de parasites asexués et sexués. La DP a été calculée selon la formule suivante : DP = (Nombre de parasites x 8000) /200. Un contrôle de qualité a été réalisée grâce à une double lecture de toutes les lames de GE/ frottis collectées. Une lame est déclarée négative en l’absence d’hématozoaires après la lecture de 200 champs. En cas de discordance des deux premières lectures, une troisième est effectuée par un technicien de laboratoire plus expérimenté, et le résultat des deux lectures allant dans le même sens était retenu et la moyenne des deux DP faite si toutefois elles sont positives. Les papiers filtres des lames positives ont été sélectionnés pour la PCR.

Génotypage moléculaire a. Extraction de l’ADN

Les papiers filtres dont les GE étaient positives avaient été choisis pour l’extraction de l’ADN. Nous avons utilisé la méthode Chelex-100 telle que décrite par Wooden et al (56) pour cette extraction. Nous avons coupé nos papiers filtres en de petits confettis que nous avons mis dans des tubes Eppendorfs. Ensuite un mélange de 1X PBS avec 0,5 % de saponine a été préparé, puis mis dans les tubes Eppendorfs contenant les confettis. Nous les avons ensuite agités dans une centrifugeuse pendant 10mn (150 rpm) et laissés incuber over night à température ambiante. Le lendemain nous avons éliminé le surnageant et lavé deux fois avec du tampon PBS. Après les deux lavages, 150 µl d’eau distillée (Q H2O) et 75 µl de 20% du mélange Chelex (5g Chelex dans 25 ml d’eau distillée) ont été ajoutés dans les différents tubes. Les tubes scellés ont été portés ensuite à ébullition à 100°C pendant 8mn (2 x 4) et laissés refroidir pendant 10 mn à température ambiante. Le surnageant de chaque tube Eppendorf a été transposé dans un tube PCR en laissant soigneusement le Chelex dans le tube Eppendorf.

Le Génotypage

Le produit d’extraction obtenu a été ensuite utilisé pour la recherche de mutations sur les gènes Pfdhps, Pfdhfr pour la SP, les gènes Pfmdr et Pfcrt pour l’AQ.

La PCR

A partir de l’ADN extrait, une double PCR a été réalisée avec un thermocycleur Primus 96 V1 19 R Biotech (Figure 6).

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I- RAPPEL SUR LE PALUDISME
I.1. Définition.
I.2. Epidémiologie.
I.3. Diagnostic.
I.4. La lutte antipaludique
II- RESISTANCES DE PLASMODIUM FALCIPARUM AUX ANTIPALUDIQUES
II.1. Définition de la résistance.
II.2. Emergence et propagation de la résistance.
II.3. Surveillance de l’efficacité et de la résistance des antipaludiques
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I. METHODOLOGIE
I.1. Cadre de l’étude
I.2. Type d’étude
I.3. Déroulement de l’étude.
I.3.1. Echantillonnage.
I.4. Analyse des données
I.5.Considérations éthiques
II.RESULTATS
II.1. Caractéristiques de la population d’étude
II.2. Prévalence palustre
II.3 Prévalence des mutations associées à la résistance à l’AQ et à la CQ 40
II.3.1- Prévalence de la mutation 86Y du gène Pfmdr1 associée á la résistance á l’AQ
II.3.2- Prévalence des mutations 76T du gène Pfcrt associée á la résistance á la CQ.
II.4. Prévalence des marqueurs moléculaires associés à la résistance de P.falciparum à la SP
II.4.1. Prévalence des simples mutations de résistance à la SP
II.4.2. Combinaison des mutations associées á la résistance de P. falciparum á la SP
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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