Soutenance mémoire
Présentation générale de Streptococcus thermophilus
Taxonomie
Streptococcus thermophilus est une bactérie lactique thermophile appartenant à la famille des Streptococcaceae comportant deux genres phylogénétiquement très proches : Streptococcus et Lactococcus. D’un point de vue génomique, 70 souches (génomes complets publiés au 1er juin 2011), sont référencées au sein de cette famille où l’on peut distinguer des espèces pathogènes de l’homme (Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae) ou de l’animal (Streptococcus suis, Streptococcus equi), d’autres espèces commensales de la bouche et pathogènes opportunistes (Streptococcus salivarius, Streptococcus vestibularis, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis et Streptococcus gordonii) et enfin des espèces non pathogènes et largement utilisées dans l’industrie laitière avec notamment Streptococcus thermophilus et Lactococcus lactis. Les caractères communs que partage cette famille sont une morphologie en coques à Gram positif de 0,5 à 1 µm de diamètre, présentant un groupement typique en diplocoques ou en chaînettes de longueur variable, immobiles, dépourvus de spores et rarement capsulés. Toutes ces espèces utilisent la voie fermentaire de dégradation des sucres simples et sont par ailleurs dépourvues de catalase. La classification originelle des espèces de streptocoques est assez complexe car pour des raisons historiques, elle a été a effectuée au départ sur la base de différences macroscopiques de pouvoir hémolytique des espèces (système Lancefield) qui ont été rapprochées à des différences immmunologiques de polysaccharides de paroi (groupes A, B, C, F et G) ou d’acides lipotéchoïques (groupe D) (Facklam, 2002). Cette classification, encore utilisée en microbiologie clinique, présente des inconvénients. En effet, par exemple S. pyogenes, auquel on associe souvent l’attribut GAS pour « Groupe A Streptococcus » n’est finalement pas le seul streptocoque à posséder l’antigène A puisque S. anginosus ou S. dysgalactiae equisimilis l’expriment également. De plus, il n’est pas rare qu’une souche donnée puisse porter en même temps plusieurs antigènes (Facklam, 2002). Il n’est donc pas évident de classer facilement les souches de streptocoques par cette méthode et particulièrement les streptocoques non béta-hémolytiques. Avec les avancées méthodologiques, des classifications sur la base de typage moléculaire ont vu le jour et permis d’établir plus solidement les relations phylogénétiques entre les espèces. Ainsi, une analyse récente, basée sur les séquences de l’ARN 16S a permis d’identifier 5 groupes majeurs appartenant au genre Streptococcus (Moschioni et al., 2010): S. mitis, S. mutans, S. salivarius, S. agalactiae et S. pyogenes (Figure 1). Cette classification présente l’atout non négligeable qu’elle est quasi parfaitement corrélée avec le potentiel pathogénique des souches ainsi qu’avec leur niche écologique préférentielle (Kawamura et al., 1995). La seule exception concerne le groupe mitis qui contient S. pneumoniae, pathogène avéré, parmi d’autres espèces commensales des voies respiratoires hautes telles que S. mitis, S. oralis ou encore S. infantis. Selon la dernière classification, S. thermophilus appartient au groupe salivarius qui comprend aussi les espèces S. salivarius, S. vestibularis et S. peroris. S. thermophilus est une bactérie homofermentaire stricte, microaérophile et dont la température optimale de croissance est de 42°C (selon les souches de 37 à 42°C). Les souches de S. thermophilus ont été isolées à partir d’environnements laitiers, mais quelques souches pourraient provenir de plantes (Michaylova et al., 2007). Afin de mieux associer les isolats atypiques, d’identifier d’éventuelles espèces nouvelles et de mieux discriminer les espèces très proches en terme de séquences d’ARNr 16S, des travaux récents proposent des alignements de séquences à partir de séquences concaténées de gènes conservés (MLST) associés à une analyse de la présence de gènes de virulence spécifiques. Ainsi par exemple, la diversité génétique de 27 souches de S. thermophilus isolées à partir de différentes sources laitières a été déterminée. Grâce à la technique de MLST basée sur la variation de la séquence des nucléotides de 8 gènes de ménage (ilvC, pepO, pyrE, grcK, ddlA, thrS, dnaE et tkt), il a été démontré une très faible divergence des séquences entre les souches de S. thermophilus (en moyenne 0,19%), qui suggère que cette espèce représente une population qui a émergé récemment (Delorme et al., 2007). En effet, le même type d’analyse effectuée sur 22 souches de S. salivarius et 9 souches de S. vestibularis isolées à partir de la cavité orale et du sang humain, montre une divergence de séquences intra-espèces plus importante (6,6% et 3,6%, respectivement). Il convient néanmoins de nuancer ces résultats du fait du biais de sélection des souches, beaucoup plus important pour S. thermophilus car provenant quasiment toutes du même environnement laitier et sélectionnées par l’industrie laitière pour les mêmes fonctions.
Utilisation industrielle de Streptococcus thermophilus
S. thermophilus est le seul streptocoque présentant un intérêt industriel au sein du genre Streptococcus. Il est d’ailleurs également le seul dans son genre reconnu comme GRAS (Generally Recognized As Safe). Les autres espèces du groupe salivarius sont des bactéries commensales de la cavité orale et du tractus gastro-intestinal. Les espèces du sous-groupe salivarius étaient considérées comme non pathogènes jusqu’à l’implication récente de S. vestibularius et S. salivarius dans des cas d’endocardite et de méningite (Doyuk et al., 2002; Idigoras et al., 2001); seul S. thermophilus n’a pas été impliqué, jusqu’à présent, dans des maladies infectieuses. Le séquençage complet des génomes de 4 souches de S. thermophilus et leur analyse révèlent l’absence ou l’inactivation des gènes liés à la virulence chez les streptocoques pathogènes (Bolotin et al., 2004; Makarova et al., 2006; Sun et al., 2011). En plus de son usage traditionnel en culture mixte avec Lactobacillus bulgaricus pour la fabrication de yaourt, S. thermophilus est utilisé pour produire nombre de fromages tels que l’Emmental, le Parmesan, le Provolone, la Mozzarella et l’Asiago (Parente & Cogan, 2004). On l’utilise aussi depuis peu pour la production de fromages de type Cheddar en combinaison avec d’autres ferments mésophiles (Awad et al., 2005). Au final, S. thermophilus joue donc son rôle essentiel de ferment dans l’industrie laitière dans la fabrication de produits laitiers dont la valeur économique est supérieure à 300 milliards de dollars par an (Datamonitor’s Dairy: Global Industry Guide, Datamonitor, 2010), les français consommant à eux seuls plus d’un million et demi de tonnes de yaourts et laits fermentés chaque année (L’économie laitière en chiffres, CNIEL, 2010). L’un des rôles principal joué par S. thermophilus en industrie laitière est de garantir une acidification rapide du lait lors de la fermentation lactique. Cette vitesse d’acidification dépendra bien sûr de la souche utilisée, de sa vitesse de production de lactate mais aussi de son potentiel génétique par rapport au système protéolytique (Courtin et al., 2002) et à l’activité uréasique (Juillard et al., 1988; Monnet et al., 2004; Mora et al., 2004). Toutefois, l’utilisation de S. thermophilus ne repose pas uniquement sur la production d’acide lactique mais également à des niveaux moindres de formate, d’acétoïne, de diacétyle et d’acétaldéhyde qui participent également à la flaveur du produit fini. D’autres aspects technologiques importants tels que la production d’exopolysaccharides (EPS) ou de bacteriocines dépendent également du potentiel génétique de la souche employée.
Adaptation au lait
Les génomes de quatre souches de S. thermophilus, la souche CNRZ1066, la souche LMG18311, la souche LMD9 et la souche ND03 ont été séquencés (Bolotin et al., 2004; Makarova et al., 2006; Sun et al., 2011). Ces génomes sont très similaires, les deux génomes des souches CNRZ1066 et LMG18311 étant les plus proches. Leur chromosome est unique et circulaire et d’une taille d’environ 1,8 Mb, avec un pourcentage en bases G + C de 39%. Chacun de ces génomes code approximativement 1900 CDS dont plus de 90% sont identiques entre les deux souches. Les différences principales concernent les gènes impliqués dans la biosynthèse de polysaccharides extracellulaires (eps, rgp), la synthèse d’une bactériocine et les gènes d’immunité associés (Bolotin et al., 2004). Les analyses comparatives des deux génomes des souches CNRZ1066 et LMG18311 ont montré que 80% des gènes de S. thermophilus sont des orthologues de gènes d’autres streptocoques, ce qui confirme bien la proximité génétique existant entre les différentes espèces de streptocoques (Hols et al., 2005). L’évolution de S. thermophilus par la perte de gènes, notamment ceux reconnus comme importants pour le pouvoir pathogène de S. pneumoniae ou S. pyogenes, est reflétée par la présence de ces gènes sous une forme non fonctionnelle (pseudogènes) ou par leur absence dans les génomes connus. La proportion relativement élevée (10-11%) des gènes de S. thermophilus correspondant à des pseudogènes, pourrait résulter de l’adaptation de S. thermophilus à l’environnement laitier. Ces pseudogènes sont, entre autres, homologues à des gènes impliqués dans le métabolisme carboné, dans le transport et la régulation. Même s’il est certain que l’évolution du génome de S. thermophilus s’est traduite par la perte d’un grand nombre de gènes, de nouveaux gènes peuvent être acquis par transfert horizontal et contribuent aussi à l’adaptation du génome à sa niche écologique. On dénombre ainsi chez cette bactérie plus de 50 séquences d’insertion dont les pourcentages en GC présentent une déviation évidente par rapport au reste du génome. Par exemple, une portion du génome de S. thermophilus provient vraisemblablement de L. bulgaricus puisqu’elle contient le gène metC qui lui est identique à 95% (Bolotin et al., 2004). Ce gène est impliqué dans la biosynthèse de la méthionine, un acide aminé faiblement présent dans le lait. Ceci suggère que l’utilisation conjointe des souches de S. thermophilus et L. bulgaricus pour la fabrication des yaourts pourrait conduire à des transferts horizontaux comme le montre une étude plus récente. Celle-ci montre qu’un groupe de gènes (cbscblB/cglB-cysE) impliqués dans le métabolisme des acides aminés soufrés a été probablement transféré du lactobacille au streptocoque ainsi que deux autres groupes de gènes impliqués dans la production de polysaccharides (Liu et al., 2009). Enfin, une autre équipe a montré que des souches de S. thermophilus isolées de fromages traditionnels italiens ont acquis la résistance à la tétracycline via des éléments génétiques mobiles (Rizzotti et al., 2009). Ainsi, il semblerait que les espèces bactériennes proches phylogéniquement et appartenant à la même niche écologique, naturellement ou du fait de leur utilisation technologique, puissent s’échanger des gènes par transfert horizontal. L’évolution du génome de S. thermophilus repose sur trois mécanismes principaux lui permettant de moduler l’intégration de nouveaux éléments génétiques : sa capacité de transformation via la compétence naturelle, la conjugaison par l’intermédiaire d’éléments intégratifs et conjugatifs (ICEs) et enfin l’existence une certaine immunité contre les virus et plasmides étrangers avec les séquences CRISPR (clustered regularly interspaced short palindrimic repeats). Récemment, S. thermophilus a été démontré comme étant naturellement compétente c’est-à- dire capable d’acquérir de l’ADN étranger (Blomqvist et al., 2006; Fontaine et al., 2010; Gardan et al., 2009). Pour les streptocoques en général, l’étape clé du développement de la compétence réside en l’induction du facteur sigma alternatif σ X ou comX. Celui-ci contrôle positivement les gènes requis pour les mécanismes permettant la transformation bactérienne et la recombinaison homologue (Johnsborg and Havarstein, 2009). Chez S. thermophilus, on sait depuis peu que l’induction de ComX repose sur l’activation d’un système de type quorum-sensing impliquant le régulateur transcriptionnel ComR et sa phéromone peptidique ComS. Actuellement, nous savons que ComS est sécrétée, maturée et réimportée à l’intérieur de la cellule par le transporteur d’oligopeptide Ami/Opp pour finalement interagir et activer ComR qui peut ainsi se fixer sur le promoteur de comX. Nous savons également que l’addition de l’heptapeptide synthétique correspondant à la partie C-terminale de ComS est suffisante pour activer le système ComRS (Fontaine et al., 2010; Gardan et al., 2009). Ainsi ce système original ComRS est à la base de l’acquisition potentielle de nouveaux éléments génétiques. Un autre élément génétique contribuant à l’acquisition de nouveaux gènes dans le génome de S. thermophilus est la présence de transposons notamment les ICEs (integrative conjugative elements), des îlots génomiques capables de s’exciser et de s’intégrer par recombinaison site-spécifique (Burrus et al., 2000; Guedon et al., 2000; Pavlovic et al., 2004). Depuis peu, il a été démontré que ces deux éléments intégratifs conjugatifs ICESt1 et ICESt3 se transféraient par conjugaison vers d’autres souches de S. thermophilus, d’autres bactéries lactiques telles que L. lactis (Bellanger et al., 2009) ainsi que des bactéries pathogènes opportunistes telles que S. pyogenes et Enteroccus faecalis. Ceci suggère que ces îlots génomiques pourraient jouer un rôle majeur dans les échanges de gènes entre S. thermophilus et les autres espèces bactériennes présentes en milieu laitier. Enfin, comme nombre de bactéries, il existe chez S. thermophilus un mécanisme de défense ciblant la multiplication des phages empêchant ainsi indirectement l’incorporation de gènes supplémentaires. En effet, son génome contient une structure dite CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), composée de répétitions de 36 bp, entrecoupées de régions appelées «spacers» qui proviennent d’ADN extrachromosomique et qui généralement suivent une série de quatre gènes cas (CRISPRassociated), nommés cas5, 1, 2 et 7 (Horvath et al., 2008). L’acquisition de ces spacers n’est pas sans effet car elle est directement reliée à une immunité contre le phage auquel appartient l’ADN du spacer. Ces CRISPR sont donc en quelque sorte la trace des invasions d’une bactérie par des éléments extrachromosomiques mais surtout confèrent aux bactéries qui les portent une immunité contre ces éléments (Barrangou et al., 2007). Les mécanismes moléculaires régissant ce véritable « système immunitaire » bactérien sont toujours à l’étude aujourd’hui et les perspectives en industrie laitière nombreuses, l’augmentation de l’immunité des souches de bactéries lactiques industrielles contre les phages dépendant de l’optimisation des loci CRISPR. Toutes ces adaptations génomiques se répercutent à l’échelle physiologique. Ainsi S. thermophilus est particulièrement bien adaptée à la croissance en présence de lactose, la principale source de carbone du lait et le convertit rapidement en lactate par fermentation. Le lactose est transporté à l’intérieur de la cellule par une perméase à lactose LacS particulièrement efficace (Foucaud and Poolman, 1992). Une fois transporté à l’intérieur de la cellule, le lactose est hydrolysé par une beta-galactosidase en glucose et galactose. Dès lors, la majorité des souches de S. thermophilus métabolise uniquement le glucose alors que le galactose est excrété dans le milieu (Hutkins et al., 1985). On notera toutefois qu’en fin de croissance dans le lait ou après le passage dans le tractus digestif où les conditions de croissance sont plus difficiles (Rul et al., 2011), il utilise probablement le galactose dans la mesure où cette voie du métabolisme avait déjà été démontrée chez la souche LMG18311 comme induite lors de l’ultime phase de croissance en lait (HerveJimenez et al., 2008). L’importance des voies de biosynthèse des acides aminés pour la croissance en lait de S. thermophilus est clairement établie (Hols et al., 2005) mais plus particulièrement celle concernant les acides aminés branchés qui constitue un facteur clé permettant la croissance optimale de S. thermophilus dans le lait (Garault et al., 2000; Herve-Jimenez et al., 2008). Puisque le lait est relativement pauvre en acides aminés libres et en peptides mais riche en caséines (80% des protéines du lait), S. thermophilus doit à la fois hydrolyser les caséines, puis transporter et dégrader les peptides ainsi générés. Afin d’hydrolyser ces caséines, la plupart des bactéries lactiques possède une protéase ancrée à la paroi dont l’activité est variable selon les souches. Dans le cas de S. thermophilus, cette fonction est assurée par la protéase PrtS, qui lorsque elle est présente, permet à la bactérie de satisfaire à ses exigences nutritionnelles et d’atteindre une population maximale en lait dix fois plus importante que les souches n’en possédant pas (Courtin et al., 2002; Fernandez Espla et al., 2000; Garault et al., 2002; Letort et al., 2002). Pour ce qui est du transport proprement dit des peptides issus de la dégradation des caséines, l’analyse des génomes montre que S. thermophilus en possède plusieurs qui pourraient assurer cette fonction mais qui restent à caractériser. Seul le système Ami a été démontré comme transporteur d’oligopeptides allant de 3 à 23 acides aminés (Garault et al., 2002). Par ailleurs, S. thermophilus possède une vingtaine de peptidases intracellulaires lui permettant de dégrader ces peptides en acides aminés (Fernandez-Espla et al., 2000; Rul and Monnet, 1997; Thomas et al., 2010). Plus récemment, une analyse protéomique comparative de la croissance de S. thermophilus en milieu M17 et en lait a montré une augmentation des quantités de protéines telles que la pyruvate formate lyase contribuant indirectement à la synthèse de purines, composés connus aussi pour être limitants dans le lait, mais aussi d’autres protéines impliquées dans la synthèse des purines (Derzelle et al., 2005). Cette étude confirme par ailleurs l’augmentation d’enzymes impliqués dans la synthèse d’acides aminés lorsque S. thermophilus est cultivé en lait (Garault et al., 2000). Enfin, une étude de la physiologie de S. thermophilus au cours de sa croissance en lait combinant à la fois protéomique et transcriptomique confirme bien cette activation des voies d’assimilation des composés azotées et de biosynthèse des acides aminés et révèle également une diversification des voies d’assimilation des sucres en phase stationnaire (Herve-Jimenez et al., 2008). Ainsi, les éléments présentés ici montrent que S. thermophilus est particulièrement bien adaptée pour se développer dans le lait.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1) Présentation générale de Streptococcus thermophilus
1.1) Taxonomie
1.2) Utilisation industrielle de Streptococcus thermophilus
1.3) Une bactérie adaptée au lait
1.4) Interaction avec Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus)
1.5) Capacités générales de résistance aux stress
2) Mécanismes généraux d’adaptation à l’environnement par des régulateurs transcriptionnels
2.1) Les systèmes à un composant ou facteurs de transcription
2.2) Les systèmes à deux composants
2.3) Les systèmes à multiples composants
3) Structures des TCS et modulation de leur activité
3.1) Structure des RR
3.1.1) Structure et rôle du domaine receveur REC
3.1.2) Structure et rôle du domaine effecteur
3.2) Structure des HK
3.2.1) Principaux domaines des HK
3.3) Modulation de l’activité d’un TCS
3.3.1) Transmission du signal HK-RR
3.3.2) Régulation de l’activité du TCS
4) Diversité des fonctions contrôlées par les TCS
4.1) TCS répondant aux stimuli physiques
4.1.1) Osmolarité (OmpR/EnvZ)
4.1.2) Température (DesR/DesK)
4.1.3) Photodétection (LovR/LovK)
4.1.4) Radiorésistance (DrrA/DrrK)
4.2) TCS répondant aux stimuli chimiques
4.2.1) Détection de dihydrogène chez Ralstonia eutropha (système Hox)
4.2.2) Réponse aux nitrates et nitrites chez E. coli (systèmes Nar)
4.3) TCS répondant à des peptides
4.3.1) Quorum sensing et système Agr contrôlant la virulence chez S.aureus
4.3.2) Régulation de la production de bactériocines par des TCS
4.4) Des exemples de TCS répondant à des stimuli multifactoriels
4.4.1) Système PhoP/PhoQ de Salmonella enterica
4.5) Conclusion
5) Grandes fonctions régulées par les TCS des streptocoques
5.1) TCS impliqués dans la virulence des streptocoques pathogènes
5.1.1) CovR, régulateur global des facteurs associés à la virulence
5.1.2) TrxR/S, système de virulence contrôlé par CovR
5.1.3) FasBCAX, système régulateur de l’adhérence aux cellules épithéliales
5.1.4) Ihk/ Irr, système contournant le système immunitaire
5.1.5) SilA/B, système impliqué dans la virulence
5.2) TCS impliqués dans la physiologie générale bactérienne
5.2.1) CiaR/H et compétence
5.2.2) WalR/H et métabolisme de la paroi
5.3) TCS contribuant à l’adaptation des streptocoques à leur niche écologique
5.3.1) Rel/RS ou Spt/RS : adaptation à la salive
5.3.2) BfrA/B : formation de biofilms
5.3.3) LevR/S : métabolisme des sucres
5.3.4) BceABRS : résistance à la bacitracine
5.3.5) le locus Blp de S. thermophilus : production d’une bactériocine
CONCLUSION GENERALE
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