Présentation du contexte biologique et médical

Présentation du contexte biologique et médical 

La médecine régénérative 

Les cellules souches
Un des grands espoirs pour la médecine de demain est le développement des biothérapies. Contrairement aux médicaments classiques issus de la chimie de synthèse, ces thérapies copient les molécules synthétisées par les organismes vivants (comme les anticorps), ou bien utilisent les organismes eux-mêmes. Parmi ces biothérapies, deux voies se démarquent : les thérapies géniques et les thérapies cellulaires car elles ont comme objectif de guérir définitivement les patients en modifiant à long terme le corps humain. La thérapie cellulaire est basée sur l’utilisation de cellules thérapeutiques pour restaurer la fonction défectueuse d’un tissu ou d’un organe. C’est en particulier une voie prometteuse pour le traitement des maladies dégénératives (caractérisées par la destruction d’une population cellulaire) comme la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, les lésions de la moelle épinière, le diabète de type 1, la dégénérescence de la rétine (DMLA)… qui ne disposent pas aujourd’hui de traitements efficaces. La régénération de tissus ou d’organes à partir de cellules thérapeutiques est appelée médecine régénérative. Les cellules qui permettent de réaliser une telle prouesse, sont les cellules souches embryonnaires, CSE, qui possèdent deux caractéristiques essentielles :

♦ l’auto renouvellement : une cellule souche peut se diviser en deux cellules filles, dont une au minimum reste souche. Elles ont donc une capacité de renouvellement illimitée.
♦ la pluripotence : ce sont des cellules indifférenciées qui sont capables de se différencier en n’importe quelles cellules différenciées de l’organisme.

Ces deux caractéristiques permettent d’envisager la production à grande échelle de cellules « médicaments ». Grâce à l’auto renouvellement nous disposons de la matière première. Et la pluripotence permet de produire une grande variété de cellules et donc de traiter un large spectre de maladies. Cependant leur utilisation pose des problèmes éthiques.

Il existe d’autres sources de cellules souches comme les cellules souches adultes, CSA, qui ont des applications plus restreintes mais posent moins de problèmes éthiques. En effet leur capacité de renouvellement est moins grande que celle des CSE (le nombre de division est grand mais pas illimité) et ce ne sont pas des cellules pluripotentes mais multipotente. Cela signifie qu’elles sont déjà engagées dans une voie de différenciation, elles peuvent donc se différencier en un certain type de cellules de l’organisme. C’est le cas par exemple des cellules souches hématopoïétiques, CSH. Ces cellules souches adultes peuvent se différencier en globules rouges, globules blancs et plaquettes, c’est-à-dire en toutes les cellules sanguines. Les CSA sont récupérées sur un organisme adulte sans remettre en cause sa viabilité. Les CSH sont par exemple récupérées à partir d’un prélèvement sanguin classique, ou dans le sang de cordon ombilical qui est un déchet après l’accouchement. Les iPS, induced Pluripotent Stem Cells. sont des cellules souches pluripotentes produites à partir de cellules adultes différenciées . C’est une autre alternative à l’utilisation des cellules souches embryonnaires, cependant pour le moment leur production pose des questions de sécurité pour une utilisation thérapeutique.

Le potentiel des thérapies cellulaires est gigantesque, car en partant de cellules souches pluripotentes toutes les fonctions d’un organisme peuvent théoriquement être restaurées. Mais il y a encore de nombreux challenges scientifiques, technologiques et éthiques avant que cette solution thérapeutique entre dans l’arsenal quotidien des médecins .

Les thérapies cellulaires

Le principe d’une thérapie cellulaire est que les cellules médicaments sont greffées chez le patient. Elles peuvent être directement mises au niveau de l’organe défectueux , ou bien être injectées dans la circulation sanguine, et se greffer elles-mêmes sur l’organe cible. Actuellement les thérapies cellulaires les mieux maîtrisées et effectuées fréquemment concernent les cellules sanguines. Cela est probablement dû à la structure liquide (contrairement à l’organisation 3D complexe des autres organes) et à la facilité d’accès et de prélèvement de cet organe. Les cellules médicaments sont les cellules souches hématopoïétiques, CSH. Ce traitement est utilisé en cas de leucémie (cancer affectant les CSH). Elles peuvent être prélevées sur le patient lui-même, dans ce cas c’est une greffe autologue, ou bien provenir d’un donneur compatible, dans ce cas c’est une greffe allogénique. Les CSH sont récupérées par un prélèvement sanguin ou bien de moelle osseuse qui contient en majorité des globules rouges, des plaquettes et des globules blancs. Au cours du traitement, les CSH sont injectées dans la circulation sanguine du patient, afin de coloniser la moelle osseuse (lieu de production des cellules sanguine par les CSH).

Il y a environ 5.10 greffes de CSH par an dans le monde. Les thérapies cellulaires sont donc des traitements encore peu répandus. Mais de nombreux essais cliniques sont en cours dans le but de développer la médecine régénérative. C’est le cas par exemple d’une start up française CellProthera, créée en 2008 par le Pr. Hénon, qui propose de traiter l’infarctus du myocarde par une injection de CSH. Après un infarctus, les CSH du patient sont récupérées. Ces cellules sont amplifiées puis réinjectées dans la circulation sanguine.

L’objectif à long terme de la médecine régénérative serait d’avoir à disposition des stocks de cellules d’intérêts thérapeutiques. Dès qu’un patient aurait besoin d’une greffe, ces banques de cellules seraient sollicitées. Le processus compliqué et limitant du don d’organe ou de recherche de donneur n’aurait plus lieu d’être.

La première étape est la génération de lignées cellulaires universelles de cellules souches pluripotentes, stables et de grade clinique. Le terme « universelle » signifie qu’elles sont compatibles avec tous les systèmes HLA (Human Leucocyte Antigen). Ces lignées seraient produites à partir de cellules souches embryonnaires, ou d’iPS. Elles seraient ensuite stockées dans des banques cellulaires, qui permettraient de lancer une ligne de production. La première étape de production serait l’amplification des cellules souches pour obtenir entre 100 et 1000 milliards de cellules. Ces cellules seraient ensuite différenciées dans le type cellulaire désiré.

L’approvisionnement de la matière première, en l’occurrence les cellules souches pluripotentes, est une question importante lorsqu’une production à grande échelle est lancée. Des équipes ont travaillé sur la génération d’iPS sans recourir à la reprogrammation génétique, mais grâce à l’action de quelques molécules . Cela rend leur production plus adaptée à une utilisation clinique du point de vue de la simplicité de production et de la sécurité . D’autres recherches sont menées sur les cellules souches embryonnaires pour dépasser les problèmes éthiques. Des études sont aussi en cours pour surmonter la barrière immunologique et les problèmes de compatibilité . Tout cela ouvre la voie à un approvisionnement à grande échelle en cellules souches. En parallèle, des recherches sont menées sur le stockage des cellules par cryopréservation  , des protocoles de mise en culture, d’amplification et de différenciation dans des conditions de production cGMP (current Good Manufacturing Production), et sur leur mise en forme en tant que « médicament ».

La recherche scientifique sur les cellules souches essaye de relever petit à petit les challenges scientifiques et techniques, dont le tri cellulaire, pour le développement d’une médecine régénérative à grande échelle.

Table des matières

Introduction générale
1. Le tri cellulaire
1.1. Présentation du contexte biologique et médical
1.1.1. La médecine régénérative
Les cellules souches
Les thérapies cellulaires
Pourquoi est-il nécessaire de trier les cellules ?
1.1.2. Le diagnostic
1.1.3. Conclusion
1.2. Etat de l’art du tri cellulaire
1.2.1. Comment identifier une fonction biologique ?
1.2.2. Les méthodes de tri basées sur des critères physiques
La densité des cellules
La taille, la forme et la déformabilité des cellules
1.2.3. Le tri par affinité
Les anticorps
Fluorescence Assisted Cell Sorting – FACS
Magnetic Assisted Cell Sorting – MACS
La chromatographie d’affinité de cellules
1.3. Présentation de la méthode de tri cellulaire étudiée
1.3.1. Principe de la technique de tri
1.3.2. Description de l’interaction spécifique ligand-récepteur
Interaction spécifique entre deux molécules en solution
Interaction spécifique entre deux molécules attachées à des surfaces
Etape de rencontre en chromatographie d’affinité cellulaire
1.4. Conclusion
1.5. Bibliographie
2. Etude de l’étape de transport permettant aux cellules d’atteindre la surface des billes
2.1. Etude expérimentale de l’étape de transport
2.1.1. Système modèle
Interaction entre les billes d’alginate et les particules
Les billes d’alginate
Les particules magnétiques
2.1.2. Présentation du dispositif expérimental
2.1.3. Quantification de la capture
2.1.4. Résultats
Mesure de la capture en fonction du temps et détermination de la constante cinétique
d’association kon
Cinétique d’association en fonction de la vitesse
Cinétique d’association en fonction de la taille des billes
Saturation de la surface des billes
2.1.5. Conclusion
2.2. Interprétation des résultats
2.2.1. Les phénomènes physiques à l’origine du transport des particules à proximité des billes
Présentation du modèle simplifié de Yao
Les interactions entre les surfaces
2.2.2. Interprétation des données expérimentales
2.2.3. Conclusion
2.3. Conclusion
2.4. Bibliographie
3. La capture spécifique
3.1. La fonctionnalisation des billes
3.1.1. Introduction
3.1.2. Fonctionnalisation des billes d’alginate
Le greffage de la streptavidine
La réactivité de la streptavidine greffée
3.1.3. Augmentation de la densité surfacique de fonctionnalisation
Le greffage de biotine sur des billes d’alginate
Le greffage de la streptavidine sur les billes de verre
3.1.4. Conclusion
3.2. La capture spécifique
3.2.1. Le système étudié
3.2.2. Montage expérimental et quantification de la cinétique de capture
3.2.3. Résultats et interprétation
Le système modèle
La capture grâce aux anticorps
3.2.4. Conclusion
3.3. La chromatographie cellulaire pour une application médicale à grande échelle
3.3.1. La section de la colonne
3.3.2. La concentration cellulaire
3.3.3. Le rayon des billes
3.3.4. La vitesse d’écoulement et la longueur de la colonne
Le tri de cellules souches après une phase d’amplification pour la thérapie cellulaire
Quels sont les avantages de la présence d’un écoulement ?
3.3.5. Conclusion
3.4. Conclusion
3.5. Bibliographie
4. Automate de tri cellulaire
4.1. Introduction
4.2. Description de l’automate de tri cellulaire développé par Bertin Technologies
4.2.1. La définition du cahier des charges
4.2.2. La zone de séparation contenant les billes pour la capture de cellules
4.2.3. L’automate dans son intégralité – stockage et distribution des différentes solutions
4.2.4. Séquence des étapes permettant de trier les cellules
4.3. Conformité de l’automate et retour d’expérience
4.3.1. Limitation de la perte des cellules dans les volumes morts
4.3.2. Montage des seringues, pousse-seringues et zone de séparation
4.4. Conclusion
4.5. Bibliographie
Conclusion générale

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