Présentation des stratégies testées pour l’implantation d’un sphéroïde unique dans une biopsie de peau

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Les modèles d’étude in vitro de la peau humaine

Afin de pouvoir étudier les fonctions de la peau et les différentes pathologies auxquelles cet organe peut être sujet, différents modèles d’étude ont été développés. En effet, bien que cet organe soit facilement accessible, les expérimentations chez l’homme sont limitées, notamment pour des raisons éthiques (Lebonvallet et al. 2010).
Il existe un grand nombre de modèles animaux, développés par exemple chez le cochon, dont la structure de la peau est similaire à la peau humaine (Jacobi et al. 2007; Godin and Touitou 2007), ou chez la souris, qui est facilement disponible et manipulable en laboratoire (Godin and Touitou 2007). Cependant, ces différents modèles ne permettent pas de reproduire fidèlement les caractéristiques de la peau humaine, notamment en termes de perméabilité : différentes études ont en effet montré une pénétration plus importante de composés chez la souris que chez l’homme (Bond and Barry 1988; Roberts and Mueller 1990). Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux tend actuellement à être réduite pour des raisons éthiques, et a récemment fait l’objet d’une interdiction dans le cas d’études dermo-cosmétiques (Gruber and Hartung 2004; Fernandes et al. 2015).
Différents modèles in vitro permettent d’étudier la peau dans un contexte entièrement humain. Ces modèles, de complexités différentes, ont été développés pour répondre à des questions et applications différentes (Mathes, Ruffner, and Graf-Hausner 2014) (Figure 6).

Les cultures cellulaires en monocouche

Les modèles les plus simples mimant la peau sont les cultures en monocouche de cellules, primaires ou provenant de lignées cellulaires.
L’isolation de fibroblastes et de kératinocytes primaires à partir de biopsies de peau humaine a été mise au point il y a plusieurs décennies (Hayflick and Moorhead 1961; Rheinwald and Green 1975). La culture de fibroblastes permet d’étudier les mécanismes de synthèse de la matrice extracellulaire du derme, mais également le rôle de ces cellules dans les processus de cicatrisation et de vieillissement cutané. La culture de kératinocytes est généralement utilisée pour modéliser l’épiderme et étudier la différenciation épidermique ainsi que la cicatrisation (Prunieras 1979; Haase et al. 2003; Deyrieux and Wilson 2007). Elle est plus difficile à réaliser que la culture de fibroblastes, car ces cellules se différencient rapidement, perdant leur capacité de division.
Afin d’étudier les interactions entre les différents types cellulaires et les mécanismes dépendant de ces interactions, des modèles de co-cultures ont également été développés. Les principaux modèles mis au point comprennent les co-cultures de kératinocytes et mélanocytes pour étudier la pigmentation de la peau (Lei et al. 2002), de kératincocytes et fibroblastes permettant l’étude des interactions entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses (Mujaj et al. 2010; Z. Wang et al. 2012), ou les co-cultures de kératinocytes et neurones pour étudier les fonctions sensorielles de la peau (Le Gall-Ianotto et al. 2012).
Ces différents modèles sont également utilisés en recherche préclinique dans le cadre de tests de cytotoxicité, ou d’évaluation de l’effet de composés. Par exemple, des modèles de coculture de kératinocyte et de mélanocytes ont permis d’évaluer l’effet de stimulants mélanogéniques tels que la MSH (Melanocyte-Stimulating Hormone) ou la 3,4-dihydroxyphénylalanine (DOPA) (Lei et al. 2002). Très faciles à mettre en œuvre, ils ne reproduisent en revanche pas la complexité et la structure en 3 dimensions de la peau.

Les modèles organotypiques

Le terme de modèle organotypique englobe 2 types de modèles différents : les modèles reconstruits et les cultures d’explants. Ces modèles, plus complexes, permettent de reproduire en partie la structure et certaines fonctions normales de la peau in vivo et de maintenir les propriétés des cellules qui les constituent, notamment grâce à leur organisation tridimensionnelle.

Les modèles reconstruits

Il existe différents types de modèles reconstruits, allant de l’épiderme ou du derme seul à des modèles de peau reconstruite.
Les dermes reconstruits sont obtenus en ensemençant des fibroblastes dans des matrices plus ou moins complexes, allant d’un simple réseau de fibres de collagène à des matrices commerciales développées spécifiquement pour cette application, jusqu’au derme désépidermisé et acellularisé, obtenu à partir d’une biopsie de peau (Oh et al. 2013; Mathes, Ruffner, and Graf-Hausner 2014). Ces modèles permettent d’étudier les interactions entre les cellules et leur matrice extracellulaire. Les épidermes reconstruits (RHE, Reconstructed Human Epidermis) reproduisent la stratification différenciée observée au sein de la peau. Ils sont obtenus en cultivant des kératinocytes à l’interface air-liquide (Mathes, Ruffner, and Graf-Hausner 2014) et sont utilisés par exemple pour tester l’efficacité et la pénétration d’agents pharmacologiques ou le potentiel irritant de molécules (Kandárová et al. 2009; Tornier et al. 2010; Van Gele et al. 2011).
Les modèles de peau reconstruite combinent les 2 compartiments, le derme et l’épiderme. Ils sont produits en plusieurs étapes (Figure 7) : dans un premier temps, des fibroblastes sont ensemencés dans une matrice de la même façon que lors de la formation d’un derme reconstruit. Après plusieurs jours de culture dans un milieu favorisant le développement des fibroblastes, des kératinocytes ou des feuillets épidermiques, séparés de biopsies de peau par digestion enzymatique, sont ensemencés ou déposés à la surface du derme équivalent. Le modèle est alors transféré dans un milieu favorisant la croissance des kératinocytes. Enfin, la différenciation stratifiée de l’épiderme est induite en maintenant la surface du modèle obtenu à l’interface air-liquide.
Ces modèles peuvent être encore complexifiés au moyen de l’ajout d’autres types cellulaires durant leur formation, tels que des mélanocytes, des cellules de Langerhans dérivées d’une lignée cellulaire ou des macrophages, des cellules endothéliales ou des adipocytes, afin d’obtenir des modèles pigmentés, immunocompétents, vascularisés ou comprenant un hypoderme respectivement (Mathes, Ruffner, and Graf-Hausner 2014).
Les modèles de peau reconstruite peuvent également être produits par bio-impression (V. Lee et al. 2014) : l’ensemencement des différents types cellulaires dans un hydrogel, généralement constitué d’un précurseur de collagène, se fait couche par couche de façon automatisée, à l’aide d’une bio-imprimante. Cette technique permet de produire des modèles avec une grande reproductibilité et en plus grand nombre que dans le cas d’un ensemencement manuel.
Les modèles de peau reconstruite, en se rapprochant de la complexité de la peau normale, permettent de réaliser des tests d’efficacité de molécules in vitro avec une réponse plus proche de celle observée in vivo que les modèles en 2 dimensions, via leur application dans le milieu de culture ou bien sur la surface de la peau (Sanquer et al. 1990). De façon plus générale, ils permettent d’étudier à la fois les interactions cellules-matrice et cellules-cellules dans un environnement tridimensionnel. Dans un autre contexte, ils trouvent également des applications en tant que substituts de peau en médecine régénérative (Bello, Falabella, and Eaglstein 2001).

Les explants en culture et le modèle NativeSkin®

Les modèles d’explants de peau sont produits à partir de prélèvements de peau provenant d’opérations de chirurgie, telles que des abdominoplasties. Immédiatement après la récupération de ces échantillons, la peau est décontaminée, redimensionnée en biopsies de taille définie et dégraissée. Les explants de peau peuvent alors être mis en culture dans leur totalité, ou après séparation du derme et de l’épiderme selon l’application souhaitée (Lebonvallet et al. 2010).
A l’inverse des modèles de peau reconstruite, ces modèles sont facilement et rapidement utilisables.
Leur utilisation est en revanche dépendante du calendrier des chirurgies, et limitée aux jours qui suivent la récupération des prélèvements biologiques.
Le modèle NativeSkin® est un modèle d’explant de peau développé et commercialisé par la société Genoskin. Suite à la récupération de prélèvements de peau, provenant principalement de plasties abdominales, la peau est dégraissée puis recoupée à l’aide d’un emporte-pièce en biopsies de forme circulaire. Ces explants sont ensuite intégrés dans une matrice nourricière semi-solide à l’intérieur d’un insert de culture, qui est déposé dans une plaque multi-puits (Figure 8). La surface du modèle NativeSkin® est maintenue à l’interface avec l’air, permettant l’application topique de composés sur le modèle. Par ailleurs, un anneau de silicone, collé à la périphérie des explants, délimite une zone définie de traitement topique, et permet d’éviter la diffusion latérale des composés appliqués.
La caractérisation du modèle NativeSkin® a révélé la préservation de différentes caractéristiques d’une peau normale au cours de 7 jours de culture, telles que la structure histologique de l’épiderme et du derme, la teneur en collagène du derme, sa viabilité cellulaire et l’imperméabilité de sa barrière (De Wever, Kurdykowski, and Descargues 2015). En outre, les mélanocytes présents dans l’épiderme du modèle conservent leur capacité à produire de la mélanine après plusieurs jours de culture (Calapre et al. 2016), et des études ont révélé une certaine immunocompétence du modèle en culture, avec la présence de cellules de Langerhans dans l’épiderme et de lymphocytes T résidents dans le derme.
Différentes études réalisées sur ce modèle ont démontré sa pertinence dans le cadre de l’évaluation d’effets de molécules pharmaceutiques appliquées à sa surface (Norsgaard et al. 2014), mais également pour des études de défaut de barrière cutanée (Duracher et al. 2015), ou nécessitant la réalisation d’injections intradermiques (données non publiées).
Ce type de modèle permet ainsi de se rapprocher au mieux des conditions in vivo et d’étudier la réaction de la peau dans son ensemble face à différents agents de stress ou traitements pharmacologiques.
Des limites similaires à celles observées dans les modèles de peau reconstruite sont cependant également associées au modèle d’explant, notamment celles liées à la culture statique des modèles (Lebonvallet et al. 2010; Mathes, Ruffner, and Graf-Hausner 2014).
Pour pallier cette limite, de nouvelles stratégies tendent à être développées, avec l’utilisation notamment de technologies de microfluidique pour recréer un environnement dynamique autour du tissu (Sakolish et al. 2016). L’application de ces techniques à la culture d’explants ex vivo s’est révélée pertinente pour reproduire des réactions similaires à celles observées in vivo lors de l’évaluation de la toxicité de composés pharmaceutiques (Abaci et al. 2015), et ouvre des perspectives en termes d’optimisation des recherches précliniques.

Voies de signalisation cellulaire impliquées dans le développement du mélanome

Différentes voies de signalisation sont dérégulées dans le mélanome au-travers de la surexpression ou de l’inhibition de l’expression de certains de leurs effecteurs (Figure 11). Ces mutations génétiques ou modifications épigénétiques contribuent au développement de la pathologie. Les principales voies dérégulées dans le cas du mélanome sont impliquées dans le contrôle de la prolifération cellulaire, l’apoptose et la sénescence. Ces voies et les principales mutations responsables de leur dérégulation dans le cas du mélanome sont résumées dans le Tableau 1.

La voie des MAPK

La voie des Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) est située en aval d’un récepteur tyrosine kinase (RTK) et suit une cascade d’activation RAS/RAF/MEK/ERK. Elle est impliquée dans le contrôle de la survie et de la prolifération cellulaires. La signalisation par cette voie joue un rôle particulièrement important dans le développement du mélanome : elle est en effet hyperactivée dans 90% des cas (Shtivelman et al. 2014). Cette activation est liée à différentes mutations, qui conduisent à l’activation constitutive de la voie et la perte du contrôle de la prolifération cellulaire. Les mutations de BRAF, codant pour une sérine / thréonine kinase impliquée dans la voie, sont les plus récurrentes (Figure 11) : elles sont retrouvées dans 50 à 70% des mélanomes. Parmi ces mutations, la substitution d’un acide glutamique par une valine à la position 600 (V600E) est la plus commune, et elle est majoritairement retrouvée dans les mélanomes se développant sur des régions non exposées au soleil de façon chronique (Shain and Bastian 2016). D’autres mutations de BRAF existent, (par exemple V600K, K601E, …) et sont associées à des lésions se développant sur des zones exposées au soleil de façon chronique. Les mutations de BRAF sont également présentes dans des naevi bénins, suggérant qu’elles interviennent précocement dans le développement du mélanome, mais ne suffisent pas à elles seules à sa progression (Poynter et al. 2006).
Une autre mutation communément retrouvée dans la voie est la mutation de NRAS, dans 15 à 30% des mélanomes. Les mutations de NRAS et BRAF sont mutuellement exclusives.

La voie PI(3)K

La voie des Phosphoinositide 3-kinase (PI(3)K) est également située en aval d’un récepteur RTK. Sa signalisation est impliquée dans la régulation de la survie et de la prolifération cellulaires, mais également de la motilité des cellules (Gray-Schopfer, Wellbrock, and Marais 2007). Cette voie est fréquemment hyperactivée dans les phases les plus tardives du développement du mélanome (Vredeveld et al. 2012). Différentes mutations et modifications épigénétiques en sont à l’origine : la perte de fonction du suppresseur de tumeur PTEN, partagée par 25 à 30% des mélanomes, ou encore la surexpression de la protéine kinase B (PKB / AKT) dans 60% des mélanomes, sont les plus courantes.
Les mutations de NRAS et PTEN sont exclusives, tandis que d’autres mutations peuvent être cumulées, telles que celles de BRAF et PTEN, dans environ 20% des cas de mélanome.

Les récepteurs tyrosine kinase (RTK)

Des mutations affectant les récepteurs RTK en amont des voies MAPK et PI(3)K ont été également identifiées de façon moins courante dans le cas du mélanome cutané, conduisant à une activation de ces voies de signalisation (Damsky, Theodosakis, and Bosenberg 2014; Shtivelman et al. 2014). Les plus courantes touchent des récepteurs de facteurs de croissance tels que c-Kit et MET, qui sont hyperactivés, ou NF1, un inhibiteur de la voie des MAPK, qui est inactivé (Lo and Fisher 2014; Shtivelman et al. 2014).

La voie p53

La voie p53 est impliquée dans le contrôle de l’apoptose et le contrôle du cycle cellulaire. Fréquemment mutée dans d’autres cancers, elle ne l’est que dans 19% des tumeurs de mélanomes (Hodis et al. 2012).
La principale mutation responsable de l’inactivation de cette voie est l’amplification de MDM4, une protéine induisant la dégradation et l’inactivation de p53, dans 65% des cas.
Des délétions du locus CDKN2A sont par ailleurs associées à 16 à 41% des mélanomes, entraînant l’inhibition de la transcription du gène suppresseur de tumeur p14ARF et l’inhibition de l’expression de TP53.
Enfin, le gène codant pour la protéine p53 est également muté dans 10 à 20% des cas.

La voie Wnt/ß-caténine

La voie de signalisation Wnt est activée dans un tiers des mélanomes, comme l’indique l’accumulation de ß-caténine dans le noyau des cellules (Lo and Fisher 2014). Cette voie canonique est impliquée dans la prolifération, la migration et la différenciation cellulaires, et pourrait jouer un rôle dans l’invasion des cellules de mélanome (Shtivelman et al. 2014).
Le facteur de transcription MITF, impliqué dans la différenciation des mélanocytes, est un des effecteurs de la voie Wnt. Son expression est amplifiée dans environ 20% des mélanomes et son niveau d’expression semble être inversement proportionnel à la survie des patients. Cependant, son rôle exact n’est pas encore compris dans le développement du mélanome (Palmieri et al. 2009).

Les modèles cellulaires en trois dimensions

Afin de se rapprocher des conditions dans lesquelles les tumeurs se développent dans leur environnement, des modèles en trois dimensions se sont développés. Ces modèles, de différentes natures, permettent de reproduire l’organisation tridimensionnelle et les caractéristiques d’une tumeur, ou même d’intégrer cette tumeur à un microenvironnement, afin d’étudier son évolution dans un système tendant à se rapprocher de celui dans lequel elle se développe in vivo.

Le modèle du sphéroïde multicellulaire

Le modèle du sphéroïde multicellulaire est actuellement admis comme reproduisant l’architecture tri-dimensionnelle et les interactions cellulaires d’un micro-domaine tumoral et son intérêt en pharmacologie anti-tumorale a été démontré par de nombreuses publications (pour revue Hirschhaeuser et al. 2010).
Ce modèle reproduit différentes caractéristiques de l’architecture d’une tumeur in vivo (Hirschhaeuser et al. 2010) (Figure 18) : au cours de sa croissance, des gradients décroissants d’oxygène et de nutriments se mettent en place de sa périphérie vers le centre. La mise en place de ces différents gradients entraîne le développement d’une hétérogénéité au sein du sphéroïde, se manifestant par la mise en place d’un gradient de prolifération au sein du sphéroïde au cours de sa culture : les cellules prolifératives se concentrent à la périphérie de la structure, là où l’accessibilité en oxygène et nutriments est la plus importante. Le nombre de cellules prolifératives diminue avec la profondeur tandis qu’à l’inverse, la proportion de cellules quiescentes augmente. Au centre du sphéroïde, les cellules ayant le moins accès à l’oxygène et aux nutriments entrent dans un processus de mort cellulaire, entraînant l’apparition d’un cœur nécrotique. Selon le type cellulaire à partir duquel le sphéroïde est produit, l’organisation de sa structure peut varier, et les distances à la périphérie à partir desquelles ces différentes zones apparaissent peuvent différer. Par ailleurs, ce modèle permet également de reproduire les interactions cellules-cellules en 3 dimensions : ce sont les jonctions intercellulaires qui participent majoritairement à la cohésion des sphéroïdes (Ivascu and Kubbies 2007).
L’organisation du modèle permet donc de reproduire l’hétérogénéité tumorale trouvée in vivo dans une microtumeur ou des micro-métastases.
Le sphéroïde multicellulaire est couramment utilisé en pharmacologie anti-tumorale et permet d’apporter une meilleure prédictibilité de l’effet d’agents thérapeutiques que les modèles cultivés en 2 dimensions, en reproduisant des mécanismes de résistance liés à l’hétérogénéité de la tumeur (Haass et al. 2008). Le modèle du sphéroïde a été utilisé dans le cadre de l’évaluation préclinique de l’efficacité du vemurafenib et a permis de prédire les effets de cette molécule observés sur modèles in vivo et durant les essais de phases cliniques II et III (Tsai et al. 2008; J. T. Lee et al. 2010; Bollag et al. 2010).
La simplicité des conditions de culture de ce modèle et la reproductibilité avec laquelle il peut être produit à partir d’une lignée cellulaire en font de nos jours un modèle de choix pour le criblage à haut débit d’agents pharmacologiques ou de banques de molécules (Vinci et al. 2012; Sirenko et al. 2015).
Cependant, ce modèle à lui seul ne permet pas d’étudier l’évolution de la tumeur dans le microenvironnement que constitue le tissu environnant et ne reproduit pas les interactions entre cellules tumorales et cellules saines. Ces interactions jouent pourtant un rôle majeur dans le développement de la micro-tumeur (Thoma et al. 2014).

Table des matières

Partie 1 : Présentation générale de la peau et de ses modèles d’étude in vitro
1. Présentation générale de la structure de la peau humaine
2. Les modèles d’étude in vitro de la peau humaine
Partie 2 : Le mélanome, développement et approches thérapeutiques
1. Facteurs de risque impliqués dans le développement du mélanome
2. Développement de la pathologie
3. Traitement du mélanome
Partie 3 : Les modèles d’étude précliniques du mélanome
1. Les modèles in vitro
2. Les modèles in vivo
3. Importance des modèles d’étude dans le développement préclinique d’un composé thérapeutique
Objectifs de la thèse
Résultats
Partie 1 : Développement d’un modèle de mélanome humain ex vivo
1. Présentation des stratégies testées pour l’implantation d’un sphéroïde unique dans une biopsie de peau
2. Impact des différentes conditions d’implantation sur l’intégrité des sphéroïdes après implantation
3. Evaluation du taux de réussite d’implantation en gélatine visqueuse
4. Analyse de l’impact de l’injection de gélatine sur la viabilité cellulaire au sein des explants de peau
5. Procédure d’obtention du modèle OncoSkin®
Partie 2 : Application du modèle OncoSkin® à l’étude du mélanome : développement de stratégies d’analyse
1. Analyse de la migration des cellules tumorales à l’échelle macroscopique
2. Analyse en trois dimensions de l’évolution du volume de la micro-tumeur
3. Caractérisation du devenir de la micro-tumeur en histologie
Partie 3 : Caractérisation de la viabilité cellulaire du sphéroïde au sein du modèle OncoSkin®
1. Caractérisation de la viabilité cellulaire des sphéroïdes de cellules de la lignée WM- 266-4 implantés
2. Evaluation de la viabilité de sphéroïdes des lignées de mélanome WM-115, d’adénocarcinome colique HCT116 et de cellules primaires de kératinocytes et de mélanocytes après implantation
Partie 4 : Evaluation de l’impact des facteurs environnementaux sur l’évolution du sphéroïde dans le modèle OncoSkin®
1. Impact des conditions d’implantation
2. Impact des facteurs sécrétés par le modèle OncoSkin®
3. Impact de la contrainte mécanique sur la viabilité des sphéroïdes
4. Impact de la viabilité de l’explant de peau sur le devenir du sphéroïde implanté
Discussion et Perspectives
Partie 1 : Perspectives d’applications et d’amélioration du modèle OncoSkin® comme modèle d’étude préclinique
Partie 2 : Implication de différents facteurs dans la mortalité des sphéroïdes implantés 
1. Impact des conditions de production du modèle OncoSkin®
2. Impact du microenvironnement du modèle OncoSkin® sur la viabilité des sphéroïdes
Partie 3 : Perspectives d’applications de la stratégie d’analyse in situ développée au cours du projet
Conclusion Générale
Matériels et Méthodes
1. Culture cellulaire
2. Culture des modèles OncoSkin® et NativeSkin®
3. Analyse en histologie
4. Visualisation des biopsies de peau et des sphéroïdes in toto
Liste des Abréviations
Références Bibliographiques

Télécharger le rapport complet