Soutenance mémoire
PRESENTATION DE LA DIARRHEE VIRALE BOVINE (BVD)
Outils de diagnostic de laboratoire pour la détection d’une circulation du virus
Des méthodes de diagnostic direct (par détection du virus BVD) ou indirect (par détection des anticorps produits à la suite d’une infection ou d’une vaccination) existent.
Pour rappel, voici un apercu des statuts sérologiques et virologiques possibles des bovins en ce qui concerne le BVDv.
Détection du virus BVD
La culture cellulaire est la méthode de référence, la plus sensible, pour la détection du virus BVDv chez les animaux infectés de plus de 3 mois (après disparition des Ac maternels). Cette méthode permet à elle seule de déterminer le caractère cytopathogène ou non d’une souche de BVDv. Historiquement, ce « gold standard » a laissé place aux techniques de détection de protéine antigénique virale (ELISA Ag) et d’amplification génique (RT-PCR).
Culture cellulaire et isolement viral
La technique repose sur une inoculation d’une culture de cellules-cibles (préférentiellement des cellules embryonnaires de cornets nasaux par exemple) à l’aide de l’échantillon à tester. L’incubation dure plusieurs jours (4 à 5). Ce temps est suffisant pour l’isolement du BVDv. Suite à cela, les cellules sont testées par immunofluorescence ou immunopéroxydase afin d’identifier le virus. L’échantillon de choix pour isoler le virus BVD est un prélèvement d’une fraction de cellules blanches extraites à partir de sang total de bovin. On préfèrera utiliser les organes lymphoïdes (rate, nœuds lymphatiques mésentériques, thymus et plaques de Peyer de l’intestin grêle) si l’animal est retrouvé mort3. Chez les animaux IPI, n’importe quel échantillon prélevé pourra être utilisé grâce à la quantité de virus présents dans l’organisme. La conservation du virus est relativement bonne et un envoi d’échantillons congelés ou réfrigérés pendant quelques jours ne modifie pas la qualité de l’isolement viral. Cependant, on dénote plusieurs inconvénients sur cette méthode, sa sensibilité (elle reste moins sensible que la RTPCR) et le risque de nombreux faux négatifs (notamment avant disparition totale des Ac neutralisants colotraux chez les IPI et chez les IT où une réponse immunitaire est en place)37,38.
Détection du virus BVD et de ses acides nucléiques par PCR
L’amplification du génome ARN du virus est possible même si l’échantillon récolté ne contient que peu de matériel viral. Cependant, cette méthode nécessite une amorce capable de reconnaître tous les types antigéniques (type BVDv-1a, BVDv-1b, BVDv-2…). Les échantillons recommandés sont les fluides acellulaires (sérum, plasma, surnageant de culture cellulaire) ou du sang total sur milieu EDTA. Les échantillons cellulaires (lait, organe…) pourront également servir de matrice à la détection de virus. La PCR est 10 à 1000 fois plus sensible et plus spécifique que la technique précédente d’isolement viral et permet la détection d’une quantité infime de génome viral39 et la différenciation du type d’infection (IT/IPI). Grâce à elle, il est possible de réaliser des mélanges (pools) d’échantillons (10 à 20) de sang mais aussi de lait de grand mélange prélevé dans le tank. De plus, cette technique permet d’éviter les faux négatifs par interférence avec les anticorps colostraux fournis par la mère.
Détection des antigènes viraux par la technique ELISA
L’ELISA Ag (« Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay » ou « dosage d’immunoabsorption par une enzyme liée ») permet une détection des antigènes viraux.
Cette technique est intermédiaire entre la culture cellulaire et la PCR au niveau de sa rapidité et son coût pour l’identification d’un virus. Concernant sa sensibilité, elle est moins sensible pour la détection des animaux infectés transitoires mais reste bonne (proche de celle du gold standard2) pour la détection d’un individu IPI dont le titre viral est très élevé.
Deux méthodes sont connues : l’ELISA avec capture d’antigène et la coloration immunohistochimique (IHC) sur tissus frais.
L’ELISA avec capture d’antigène repose sur une méthode de détection d’antigène viral en « sandwich ». Tout d’abord une plaque de micro-titrage tapissée d’un mélange d’anticorps monoclonaux est synthétisée. Elle servira à fixer les antigènes si ces derniers sont présents dans le sérum. Enfin, un mélange contenant des anticorps monoclonaux conjugués à une enzyme révélatrice (peroxydase) est ajouté. Ainsi, ces anticorps viendront prendre en « sandwich » les antigènes recherchés qui sont : NS2-3 (protéine non structurale conservée chez les Pestivirus), E0 et E2 (protéines structurales variant au cours des mutations par réplication).
L’IHC est une technique réalisée sur des prélèvements provenant de biopsies d’oreilles, aussi appelés « ear notch ». Une fois collectés, ces échantillons seront tout d’abord fixés dans du formol pour leur transport. A leur arrivée au laboratoire ils seront paraffinés, débités en fines lamelles et réhydratés. Pour finir, ils subiront une coloration par IHC avant d’être analysés par lecture microscopique.
Méthodes de détection sérologique
Les anticorps spécifiques du virus BVD sont produits à la suite d’une exposition naturelle à une souche sauvage ou d’une vaccination sur un individu immunocompétent. Deux catégories de techniques se distinguent pour la mise en évidence de ces anticorps : les tests de nature enzymatiques (ELISA indirect ou de compétition) et la séroneutralisation.
Test de séroneutralisation
La technique de séroneutralisation est une technique quantitative permettant de connaître le taux d’anticorps dirigés contre le BVDv dans le sérum testé. Ce dernier est dilué avant d’être mélangé avec la suspension virale. Après incubation le mélange est réparti de façon homogène sur une culture cellulaire de l’hôte du virus. Après quelques jours, la concentration du virus (en unité formant plage UFP) peut être estimée, par lyse cellulaire si une souche cyto-pathogène (CP) a été utilisée ou par immunofluorescence directe ou indirecte si une souche NCP a été utilisée. La concentration en anticorps anti-BVD sérique de l’individu est calculée par les plages où l’ensemble du virus n’a pu être neutralisé par les anticorps. Considérée comme la méthode de référence pour la détection des anticorps sériques d’un individu testé, elle est sensible et spécifique, mais difficile à mettre en place à l’échelle d’un cheptel car elle reste coûteuse et le délai d’attente est de plusieurs jours. Les tests immunoenzymatiques (ELISA) sont donc préférés.
Test immunoenzymatiques (ELISA)
Ces tests s’effectuent sur des échantillons individuels de sérum et sont les tests les plus fréquemment utilisés en routine39. Les deux principales techniques sont l’ELISA de compétition et l’ELISA indirect.Une microplaque sur laquelle sont fixés des antigènes du virus BVD (souvent une protéine conservée telle que NS2-3) est utilisée. Du sérum à tester est versé, si celui-ci contient les anticorps spécifiques pour l’antigène fixé sur la microplaque, ceux-ci se fixent sur les antigènes. Après un simple rinçage, des anticorps anti-immunoglobulines spécifiques d’espèces couplées à une enzyme peroxydase se fixent à l’anticorps de l’échantillon à tester. L’enzyme, en présence de son substrat chromogène émet un signal lumineux. Ce dernier est proportionnel à la quantité d’enzymes présentes et ainsi à la concentration d’anticorps recherchés. La microplaque est lue par spectrophotomètre. Le tableau 5 résume les méthodes de détection, leurs points forts et leurs points faibles.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Contrôle et éradication de la diarrhée virale bovine (BVD) en Europe |
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Table des matières
TABLE DES ANNEXES
TABLE DES ILLUSTRATIONS
LISTE DES ABBREVIATIONS
I. INTRODUCTION
II. PRESENTATION DE LA DIARRHEE VIRALE BOVINE (BVD)
1. Historique
2. Pathogénie et conséquences cliniques des infections transitoires et persistantes
a. Infection transitoire hors gestation
b. Infection transitoire en période de gestation
c. Infection persistante
3. Epidémiologie du virus BVDv
a. Epidémiologie descriptive
b. Epidémiologie analytique
4. Outils de diagnostic de laboratoire pour la détection d’une circulation du virus
a. Détection du virus BVD
b. Méthodes de détection sérologique
5. Contrôle et éradication de la diarrhée virale bovine (BVD) en Europe
a. En Allemagne
b. En Suède
c. En Suisse
d. En Norvège
e. En Autriche
f. En Ecosse
g. Aux Pays-Bas
h. En France
III. MATERIELS ET METHODES
1. Sélection des articles
2. Construction des bases de données
a. Objectifs des jeux de données
b. Présentation des paramètres d’intérêt
c. Les jeux de données
3. Méta-Regression
a. Nature du modèle
b. Biais d’études et de publications
c. Conduite de la méta-régression
d. Sensibilité du modèle principal
IV. RESULTATS
1. DS 1 : Estimation du coût individuel (par vache) annuel d’une infection par le BVDv
a. Modèle principal
b. Modèles dissidents
2. DS 2 : Evaluation de la baisse du coût individuel (par vache) de la circulation du virus après mise en place d’une mesure de contrôle (vaccination, biosécurité et détection/élimination des IPI) 60
V. DISCUSSION
1. Méthodes utilisées
2. Résultats
VI. CONCLUSIONS
VII. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
VIII. ANNEXES
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