Soutenance mémoire
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Préparation et conservation du matériel végétal
Les feuilles fraîches sont lavées à l’eau distillée puis séchées à l’air libre pendant une semaine. Elles sont ensuite broyées à l’aide d’un mortier. La poudre fine obtenue par tamisage du broyat constitue notre matériel de départ ; elle est conservée au congélateur (-20°C).
LES PRODUITS CHIMIQUES
La plupart des produits chimiques utilisés pour réaliser ce travail sont purs, de qualité pour analyse (marque MERCK, PROLABO ou BDH).
Les plaques de gel de silice utilisées pour la chromatographie sur couche mince (60F254, de dimensions 20 x 20cm) sont de marque MERCK. Le gel de silice épais de 0,2mm est étalé sur feuille plastique.
METHODES
METHODES D’EXTRACTION
Dépigmentation du matériel végétal
La poudre de feuilles sèches est placée dans une cartouche en papier filtre, puis dépigmentée par extraction par l’acétone au soxhlet à 70°C pendant 36 à 48 heures. La poudre ainsi traitée est séchée à l’air libre.
Extraction à froid
La poudre de feuilles est mise en suspension dans le solvant d’extraction (l’eau distillée ou l’éthanol absolu), selon le rapport 1/10 (p/v). La suspension est ensuite soumise à une agitation magnétique pendant 3h à la température ambiante, puis laissée macérer à 4°C pendant une nuit. Le macérat est filtré sur 4 épaisseurs de gaze pour éliminer les tourteaux. Le filtrat obtenu est centrifugé à 2200 tours/min pendant 30min. Le surnageant est ensuite concentré par évaporation du solvant d’extraction (voir méthode de concentration p 11), tandis que le culot est éliminé.
Une seconde centrifugation à 2200 tours/min pendant 15min est faite pour éliminer le précipité apparu au cours de la concentration.
Extraction à chaud
La poudre de feuilles est délayée dans de l’eau distillée ou de l’éthanol absolu suivant le rapport 1/10 (p/v). Le mélange est soumis à un chauffage à reflux sous agitation magnétique pendant 2h à 60°C puis laissé macérer à 4°C pendant une nuit. Le macérat est filtré sur 4 épaisseurs de gaze, puis le filtrat obtenu est centrifugé à 2200 tours/min pendant 30min. Le surnageant est concentré par évaporation et le culot est éliminé.
METHODES DE PURIFICATION
Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)
Principe
L’acétate neutre de plomb, comme la plupart des sels de métaux lourds, permet la défécation d’extraits biologiques, par précipitation des macromolécules telles que les protéines, les acides nucléiques, les polysaccharides ainsi que d’autres molécules comme les acides organiques.
Mode opératoire
Un volume déterminé d’une solution aqueuse d’acétate neutre de plomb à 20 (p/v) est versé dans l’extrait à traiter sous agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par centrifugation à 2200 tours/min pendant 15min. L’addition d’un volume déterminé d’une solution aqueuse de phosphate disodique à 10 (p/v) permet d’éliminer l’excès de plomb dans le surnageant.
Le précipité est éliminé de nouveau par centrifugation à 2200 tours/min pendant 15min. Le surnageant est recueilli.
Filtration sur charbon actif
Principe
Le charbon actif est un support chromatographique qui permet d’adsorber toutes les substances à structure aromatique. Son pouvoir adsorbant est très élevé.
Mode opératoire
La technique utilisée est celle mise au point par JEANNODA (1986). Une couche de charbon actif est déposée dans un entonnoir au-dessus d’un bouchon formé de fibres de verre tassées. L’entonnoir est adapté à une fiole reliée à une pompe à vide.
La solution à traiter est filtrée sous pression réduite sur la couche de charbon actif préalablement imprégnée d’eau distillée. Le traitement est suivi de plusieurs rinçages à l’eau distillée.
L’extrait incolore obtenu est filtré sur papier filtre pour éliminer les fines particules de charbon. Il est concentré par évaporation sous pression réduite.
Précipitation par l’éthanol 50
Principe
Cette technique est basée sur la diminution de la polarité et du pouvoir dissolvant d’un milieu aqueux après un ajout de solvant organique miscible à l’eau. Les molécules peu solubles et les grosses molécules précipitent.
Mode opératoire
De l’éthanol absolu est additionné petit à petit (v/v) à un volume déterminé d’un extrait aqueux, sous agitation magnétique. Le mélange est laissé reposer pendant 15min à 4°C. Le précipité apparu est ensuite éliminé par centrifugation à 2200 tours/min pendant 15min. L’alcool est évaporé du surnageant tandis que le culot est repris dans de l’eau distillée.
Dialyse
Principe
Cette technique permet la séparation des substances, en utilisant leur capacité respective à franchir les pores calibrées d’une membrane artificielle appelée membrane de dialyse qui se présente sous forme de cylindre allongé ou boudin de dialyse. Grâce à sa perméabilité sélective, cette membrane permet le passage de petites molécules vers le milieu extérieur et la rétention de grosses molécules en impliquant le phénomène d’osmose.
Les solutés diffusent de la solution la plus concentrée vers la solution la plus diluée. Ce phénomène s’arrête dès que les concentrations dans ces deux compartiments sont égales (MAHUZIER et HAMON, 1990 et KAMOUN, 1991).
Les facteurs qui peuvent influencer la vitesse de la dialyse sont :
• la température
• le diamètre des pores de la membrane
• le pH
• le temps de contact
• la différence de concentration entre les deux milieux
Mode opératoire
Préparation du boudin de dialyse
Les glycérines, les composés sulfurés et les métaux lourds présents à la surface de la membrane de dialyse doivent être éliminés. La technique usuelle consiste à bouillir la membrane dans de l’eau distillée pendant 15min, l’eau est ensuite éliminée puis le traitement est répété 3 à 4 fois. La membrane ainsi préparée est conservée dans de l’eau distillée à 4°C.
Avant chaque utilisation, la membrane doit être rincée à l’eau distillée.
Mise en œuvre de la dialyse
Le fragment de boudin à dialyse contenant l’extrait à dialyser est fermé à chaque extrémité par un nœud. Il est introduit dans le liquide de contre-dialyse (100 fois le volume de l’extrait) et l’ensemble est soumis à une agitation magnétique afin d’éviter la formation d’un gradient de concentration au voisinage du boudin. Le liquide de contre-dialyse est renouvelé fréquemment pour accélérer la diffusion et maintenir la différence de concentration entre les deux milieux.
Traitement par la chaleur
Principe
Cette méthode est utilisée pour éliminer certaines macromolécules telles que les protéines qui coagulent sous l’effet de la chaleur.
Mode opératoire
L’extrait à traiter est chauffé dans un bain-marie bouillant pendant 15min à 96°C. Le précipité formé est écarté par centrifugation à 2200 tours/min pendant 15min. Le surnageant est recueilli et le culot est éliminé.
Fractionnement par le n – butanol
Principe
C’est une méthode d’extraction liquide-liquide basée sur le transfert d’un ou de plusieurs constituants d’une phase liquide (phase aqueuse) vers une autre phase liquide extractive (phase butanolique) qui est non miscible à la précédente (KAMOUN, 1977).
Mode opératoire
L’extrait à traiter est mélangé volume à volume au n-butanol dans une ampoule à décanter. Après une forte agitation, le mélange est laissé reposer jusqu’à la séparation totale de deux phases : une phase supérieure butanolique et une phase inférieure aqueuse.
La phase aqueuse subit de nouveau quatre fractionnements successifs. Les 5 phases organiques ainsi obtenues sont rassemblées puis filtrées sur papier filtre pour éliminer les éléments insolubles. Le filtrat est ensuite évaporé après addition d’eau distillée. Le butanol résiduel de la phase aqueuse est également évaporé après addition d’eau distillée.
METHODES DE CONCENTRATION
Toutes les opérations d’évaporation de solvants et de réduction de volume sont réalisées au moyen d’un évaporateur rotatif HEIDOLPH à la température 50 – 55°C. La pression est réduite à l’aide d’une pompe à vide.
METHODES D’ANALYSE
Chromatographie sur couche mince
Principe
La chromatographie sur couche mince est un procédé d’analyse au cours duquel les substances à séparer migrent suivant une direction déterminée. La vitesse de déplacement des substances dépend de leur affinité pour la phase mobile organique d’une part et des forces d’adsorption dues au support d’autre part.
Mode opératoire
• Dépôt des échantillons
Les extraits sont analysés sur une plaque prête à l’emploi découpée aux dimensions voulues. Ils sont déposés à l’aide d’un capillaire à 1,5cm du bord inférieur et à partir de 1,3cm des bords latéraux, en tirets de 7mm de large, espacés de 6mm. Les dépôts sont séchés au moyen d’un séchoir à main.
• Développement
La chromatographie ascendante se déroule dans une cuve à chromatographie DESAGA, préalablement saturée par les vapeurs du solvant de migration grâce à l’application de papier filtre imprégné du solvant contre ses parois internes. Le système de solvants utilisé comme solvant de migration est le Butanol / Acide acétique / Eau (B/A/E), 60/20/20 (p/p).
Lorsque le front du solvant se trouve à 0,5cm du bord supérieur de la plaque, la chromatographie est arrêtée. La plaque est ensuite retirée de la cuve puis séchée à l’aide d’un séchoir à main.
• Révélation des chromatogrammes
Les chromatogrammes sont révélés par deux méthodes :
– La migration des substances est visualisée sous lumière ultraviolette de longueurs d’onde 254nm et 366nm.
– Les taches apparues sont révélées par pulvérisation d’un réactif spécifique : le réactif à la ninhydrine ou le réactif à la vanilline sulfurique.
Composition des réactifs :
Réactif à la ninhydrine
– Ninhydrine ………………………….. 3 g
– Collidine…………………………….. 30 ml
– Acide acétique…………………… 100 ml
– Ethanol absolu …………. q.s.p 1000 ml
La pulvérisation de ce réactif entraîne l’apparition de taches roses ou violettes quelques minutes après séchage à l’air chaud.
Réactif à la vanilline sulfurique
-Vanilline……………………………………… 0,5 g
-Acide sulfurique concentré ………… 100 ml
Après pulvérisation de ce réactif, des taches roses apparaissent et deviennent noires après chauffage à l’étuve à 120°C pendant 5min.
Criblage phytochimique
Pour chaque opération de détection, 1ml de l’extrait à étudier est évaporé à sec.
Les alcaloïdes
Macération chlorhydrique
Le résidu obtenu par évaporation à sec est macéré dans 3ml de HCl 2N, la solution est ensuite filtrée sur papier filtre. Le filtrat est réparti dans 4 tubes à essai dont le premier servira de témoin. Les trois autres tubes sont utilisés pour le test des alcaloïdes en utilisant trois réactifs : réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF.
La composition de ces réactifs est donnée en annexe 2.
Déroulement des tests
Cinq gouttes de réactif de MAYER sont ajoutées dans un tube. L’opération est répétée pour les 2 autres réactifs. L’apparition d’un précipité ou d’une floculation indique la présence d’alcaloïdes dans l’extrait à tester (CORDEL, 1981 ; BRUNETON, 1993).
Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes
Flavonoïdes : Test de WILSTATER
(Test à la cyanidine)
Le résidu sec est dissous dans 3ml d’éthanol 80 puis filtré sur papier filtre. La solution obtenue est répartie dans 4 tubes à essai dont un sert de témoin. Dans le deuxième tube, 0,5ml d’acide chlorhydrique concentré et 2 tournures de magnésium sont ajoutés.
Dans le troisième tube, en plus des constituants mis dans le deuxième tube, 1ml d’eau distillée et 1ml d’alcool isoamylique sont versés.
Le changement de la coloration dans le second et le troisième tube traduit la présence de flavonoïdes :
– coloration rouge pour les flavones
– coloration rouge violacée pour les flavonones
– coloration pourpre pour les flavonols
Leucoanthocyanes : Test de BATE – SMITH
Au quatrième tube de l’expérience précédente est ajouté 0,5ml d’acide chlorhydrique concentré, puis le mélange est placé dans un bain marie bouillant pendant 30min.
Après refroidissement, l’apparition d’une coloration rouge indique la présence de leucoanthocyanes (FONG et coll., 1977).
Les tanins et les polyphénols
Le résidu d’évaporation est repris dans 3ml d’eau distillée chaude. Le mélange est partagé dans 4 tubes à essai. Le premier tube est utilisé comme témoin tandis que les 3 derniers tubes sont réservés aux 3 différents tests.
Test à la gélatine
Quatre gouttes de gélatine à 1 (p/v) sont ajoutées dans le deuxième tube. La présence de tanins hydrosolubles de type catéchique dans l’extrait est montrée par la formation d’un précipité blanc.
Test à la gélatine salée
Quatre gouttes de gélatine salée (gélatine aqueuse à 1 + NaCl 10 ) sont ajoutées dans le troisième tube. La présence de tanins condensés de type pyrogallique se traduit par l’apparition d’un précipité.
Test au chlorure ferrique
Quatre gouttes de chlorure ferrique (10) en solution méthanolique sont additionnées dans le quatrième tube. Un précipité de couleur bleu verdâtre caractéristique apparaît pour les tanins de types catéchols tandis qu’une coloration bleuâtre révèle la présence de tanins de types pyrogallols.
Une réaction négative à la gélatine salée accompagnée d’une coloration verte ou bleu noir pour le test au chlorure ferrique sont dues à la présence d’autres composés phénoliques (HEMINGWAY et KARCHESY, 1989).
Les anthraquinones : Test de BORNTRÄGER
Un volume de benzène est additionné d’un même volume de la solution aqueuse du résidu sec. Le mélange est placé dans une ampoule à décanter. Après une forte agitation, ce mélange est laissé au repos. La formation de deux phases est observée : la phase aqueuse et la phase organique benzénique. Cette dernière est recueillie puis ajoutée de 5 gouttes d’ammoniaque 25.
Après agitation, la présence d’anthraquinones dans l’extrait est indiquée par le virage de la coloration de la phase alcaline (phase inférieure) en rouge.
Les saponines
Le résidu sec est dissous dans 1ml d’eau distillée. La solution obtenue est soumise à une agitation énergique pendant 30s. L’apparition d’une mousse de 3cm de hauteur, persistant pendant 30min indique la présence de saponines dans l’extrait (FONG et coll., 1977).
Les stéroïdes et les triterpènes
Le résidu sec est repris dans 3ml de chloroforme. Le mélange est filtré puis distribué dans 3 tubes à essai dont le premier sert de témoin.
Test de LIEBERMANN – BURCHARD
Dans le deuxième tube, 2 gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées. Après une agitation légère, un ajout de quelques gouttes d’acide sulfurique est effectué.
L’apparition d’un anneau rouge ou violet prouve la présence de triterpènes tandis que le développement d’une coloration verdâtre dans la phase aqueuse supérieure est spécifique des stéroïdes. Les deux phénomènes peuvent être observés simultanément.
Test de SALKOWSKI
Un ml d’acide sulfurique est additionné dans le troisième tube incliné. La présence de stérols insaturés dans l’extraits est vérifiée par la formation d’un anneau rouge, violet ou mauve à l’interface (NOHARA,1989).
Les désoxyoses : Test de KELLER – KILIANI
Le résidu sec est repris dans une solution aqueuse de chlorure ferrique à 10 additionnée d’acide acétique glacial. Le mélange est agité légèrement puis de l’acide sulfurique concentré est ajouté volume à volume en inclinant le tube. L’extrait contient des désoxyoses lorsqu’un anneau pourpre se forme à l’interface (FONG et coll., 1977).
Les iridoïdes
Le résidu d’évaporation est dissous dans 1ml d’eau distillée. La solution obtenue est agitée puis additionnée de 0,5ml d’acide chlorhydrique concentré. Le mélange est chauffé au bain marie bouillant pendant 30min.
La présence des iridoïdes est montrée par l’apparition d’une coloration bleue après refroidissement.
RESULTATS
Les expériences préliminaires sur les feuilles et les tiges de Olax lanceolata ont montré la présence de principes toxiques. Cependant, nous avons choisi d’étudier les principes toxiques des feuilles d’abord, à cause de l’abondance de ce matériel.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
ETUDE CHIMIQUE DES
PRINCIPES TOXIQUES
1 – INTRODUCTION
2 – MATERIELS ET METHODES
2.1 – Matériels
2.1.1 – La plante
2.1.1.1 – Classification
2.1.1.2 – Description botanique
2.1.1.3 – Distribution géographique et lieu de récolte
2.1.1.4 – Organes utilisés
2.1.1.5 – Préparation et conservation du matériel végétal
2.1.2 – Les produits chimiques
2.2 – Méthodes
2.2.1 – Méthodes d’extraction
2.2.1.1 – Dépigmentation du matériel végétal
2.2.1.2 – Extraction à froid
2.2.1.3 – Extraction à chaud
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