Préparation des solutions et spectromètres de DNPA

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Intérêts de la spectroscopie neutronique

Le repliement des protéines est encore mal connu à ce jour. L’utilisation de la diffusion de neutrons aux petits angles permet d’étudier ce phénomène par le biais de l’étude des états dénaturés des protéines. A l’aide de la théorie des polymères, on peut caractériser les états dénaturés des protéines.
Une fois la structure tridimensionnelle adoptée, divers mouvements à différentes échelles de temps existent au sein d’une protéine : depuis la femtoseconde pour les réarrangements électroniques, en passant de la picoseconde à la nanoseconde pour les fluctuations thermiques, à la milliseconde pour les changements conformationnels, de la seconde à la minute pour les cinétiques et les divisions cellulaires. Les protéines impliquées dans les processus catalytiques nécessitent une flexibilité interne. L’intérêt de l’utilisation de la diffusion de neutrons en dynamique est justifié par le fait qu’il est possible d’accéder à des temps du même ordre de grandeur que ceux des mouvements qui ont lieu dans les protéines depuis la libration des groupes enfouis (10-11 s à 10-9 s) jusqu’aux vibrations des atomes (10-14 s à 10-13 s) et à une échelle spatiale de 1 à 20 Å44.
Des études structurales de solutions de protéines sous pression ont été réalisées en diffusion de neutrons.
Des études par diffusion de neutrons aux petits angles sur la metmyoglobine de cœur de cheval ont été menées par Loupiac et al45 en 2002 afin d’observer l’influence de la pression jusqu’à 3000 bar sur le rayon de giration extrapolé à concentration nulle et les interactions intermoléculaires. Le volume spécifique molaire de la metmyoglobine en fonction de la pression a pu être déterminé par cette technique. Les auteurs ont montré que le rayon de giration de la metmyoglobine restait constant et que les interactions intermoléculaires étaient toujours répulsives, entre la pression atmosphérique et 3000 bar. Mais la valeur du volume spécifique partiel de la protéine décroît de 5.4% dans cette gamme de pression.
Paliwal et al46 ont aussi utilisé la diffusion de neutrons aux petits angles en plus de la simulation par dynamique moléculaire afin d’étudier l’influence de la pression jusqu’à 3000 bar sur la structure de la nucléase du staphylocoque et plus particulièrement sur la transition dépliement/repliement de la protéine. Les auteurs ont montré une augmentation du rayon de giration en deux étapes et une modification de la forme de la protéine qui devient moins compacte et est plus allongée que la structure native lorsque la pression est appliquée.
L’influence de la pression entre la pression atmosphérique et 900 bar sur la dynamique interne de la trypsine en solution47 a été étudiée en 2000. Les auteurs ont montré une diminution du volume de diffusion des protons ainsi qu’un rétrécissement de la largeur du facteur de structure dynamique S(q,) indiquant un ralentissement de la dynamique interne de la trypsine. En 2003, Doster et Gebhardt48 ont observé l’influence de la pression jusqu’à 7000 bar sur la dynamique interne de la myoglobine par diffusion quasiélastique de neutrons. Les auteurs ont observé un ralentissement de la dynamique avec une transition de la dynamique à partir de 3000 bar, pression à partir de laquelle la myoglobine ne conserve plus sa structure native.

Présentation du travail de thèse :

Notre travail de thèse est centré sur l’étude de l’influence de la température et de la pression sur la structure et la dynamique du BPTI en solution.

Description du système

L’inhibiteur de la trypsine pancréatique bovine ou BPTI49 est une protéine impliquée dans la régulation de la catalyse enzymatique et est sécrétée dans les cellules acineuses du foie. Cette protéine a pour fonction d’inhiber la fonction d’une protéase : la trypsine, qui hydrolyse d’autres protéines en peptides et en acides aminés. Le BPTI se lie très étroitement à la trypsine en insérant la chaîne latérale de sa lysine 15 au niveau de son site actif, ce qui fait de cet inhibiteur un excellent analogue de substrat. La demi-vie de ce complexe trypsine – inhibiteur est de plusieurs mois50. Le BPTI a une très forte affinité pour la trypsine parce que sa structure est presque parfaitement complémentaire de celle du site actif de la trypsine.
Le BPTI est une protéine globulaire composée de 58 résidus d’acides aminés et de masse moléculaire de 6500 Da. Elle fut isolée en 1936 par Kunitz et Northrup2, ce qui lui valut le nom de réactif de Kunitz ou antiprotéase de type Kunitz. Sa structure tridimensionnelle à l’état natif est connue à haute résolution (1.5Å)51. Cette protéine possède six cystéines formant trois ponts disulfures notés [5-55], [14-38], et [30-51] et trois ponts salins (Asp50 – Lys46, Glu7 – Arg42, and Arg1 – Ala58)52 contribuant fortement à la très haute stabilité de la protéine.
L’intérêt d’étudier le BPTI réside dans le fait qu’il s’agit d’une protéine modèle largement étudiée par différentes techniques mais qui reste encore peu connue dans le domaine de la diffusion de neutrons. Cette protéine est utilisée dans de nombreux domaines comme la médecine où elle est employée à titre d’anticoagulant lors d’opérations chirurgicales ou encore pour le traitement de certaines maladies cardio-vasculaires (Trasylol).
Les études structurales les plus récentes par diffusion de rayons X aux petits angles et cristallographie ont été menées par Cyril Hamiaux dans sa thèse53 : il met en évidence que les trois formes cristallines différentes obtenues en présence de thiocyanate de potassium, de chlorure de sodium ou de sulfate d’ammonium, présentent un motif commun sous la forme d’un décamère de BPTI.
Les rares études du BPTI dans son état natif par diffusion de neutrons aux petits angles ont été réalisées par Budayova-Spano et al54 en 2000. Le but était d’étudier la solubilité du BPTI dans l’eau lourde par rapport à sa solubilité en eau légère, étude faite par diffusion de rayons X par Lafont et al55. On a montré que le BPTI était moins soluble dans D2O que dans H2O. D’autre part, des mesures en diffusion de la lumière ont montré que les interactions attractives entre les molécules de BPTI sont plus fortes dans D2O qu’en H2O. Le rayon de giration de la protéine observé en solution de D2O avec 0.5 M NaCl est de 12 Å53.
Les études du BPTI par diffusion inélastique de neutrons ont essentiellement été réalisées sur le spectromètre à temps de vol IN6 par Cusack, Smith et Karplus56,56,57,58,59. Le but était d’analyser les résultats des expériences par le biais de calculs théoriques basés sur l’analyse en modes normaux du BPTI. Les premières études ont été publiées en 198657 et comparent les mesures de diffusion de neutrons en temps de vol aux calculs théoriques basés sur l’analyse en modes normaux sur une solution de BPTI dans la région des basses fréquences (de 1 à 200 cm-1). Une analyse en mode normal du BPTI a été associée à des résultats d’expérience de diffusion de neutrons en temps de vol dans la région des phonons afin de déterminer la dynamique vibrationnelle du BPTI. En 1988, Cusack et al58 réalisent une étude de comparaison entre théorie et expérience sur une poudre de BPTI. Les résultats d’expérience de diffusion de neutrons en temps de vol et plus particulièrement les densités d’état généralisées ont été comparées avec deux calculs théoriques basés sur des analyses en modes normaux. Des travaux de Smith et al59 concernent des scans élastiques en fonction de la température sur le spectromètre à temps de vol IN6 avec des poudres hydratées (h= 0.07 à 0.20). Les auteurs ont montré que la dynamique était approximativement harmonique à basse température ou à basse hydratation et qu’il y avait une diffusion quasiélastique à haute température ou haute hydratation mais ils n’ont pas fait de mesures quasiélastiques. D’autre part, des scans inélastiques ont été réalisés par la même équipe 60sur le spectromètre à temps de vol IN6 avec une solution de BPTI. Les auteurs se sont limités aux observations suivantes : dans un spectre en temps de vol, ils ont montré que la diffusion inélastique du BPTI, en solution, était similaire à celle de la poudre pour des temps de vol courts, c’est à dire pour des fréquences supérieures à 50 cm-1. Ils ont observé une augmentation de la diffusion inélastique pour la solution de BPTI, pour des temps de vol longs, c’est à dire pour des fréquences inférieures à 50 cm-1 ; ce qui a été interprété en termes d’une augmentation des fluctuations atomiques.
Des études de la dénaturation du BPTI ont déjà été réalisées, les premières par Creighton61 : la réduction des ponts disulfures suffit à obtenir une chaîne dépliée. Les études les plus récentes61,62,63,64,65 ont montré que les agents chimiques dénaturants tels que l’urée et le chlorure de guanidinium n’avaient aucun effet. Même le chlorure de guanidinium, à forte concentration, ne dénature pas la protéine complètement. Seul le thiocyanate de guanidinium est capable de dénaturer le BPTI dans une gamme de concentrations raisonnables (~5 M)62. La dénaturation par la température du BPTI a été étudiée par microcalorimétrie différentielle63 et par spectroscopie Raman64 et les résultats ont montré qu’il faut une température voisine de 100°C pour dénaturer le BPTI. La dénaturation du BPTI en solution a été étudiée par infrarouge en fonction de la pression appliquée. On a montré qu’une pression de 2 kbar est nécessaire pour induire des changements au niveau des structures secondaires de la protéine. On a montré qu’en dessous de 15kbar il n’y avait pas de modifications significatives des structures secondaires65. Mais d’autres expériences en infrarouge ont montré une transition vers 5,5 kbar66. Des expériences de simulation par dynamique moléculaire (800 ps) sur le BPTI dans l’eau ont été réalisées en appliquant des pressions jusqu’à 20 kbar67. Les résultats ont montré une exposition au solvant des résidus appartenant au cœur de la protéine et une dénaturation des structures secondaires entre 10 et 15 kbar.

Caractérisation de l’état natif du BPTI en solution.

Dans un premier temps, nous nous sommes attachés à caractériser la structure de la protéine en solution dans son état natif. Nous avons procédé à des expériences de diffusion de neutrons aux petits angles afin de déterminer le rayon de giration de la protéine native et de caractériser à température ambiante et à pression atmosphérique les interactions intermoléculaires.

Caractérisation des états dénaturés du BPTI en solution.

– Influence de la température sur la structure
Une étude par diffusion de neutrons aux petits angles a été réalisée afin d’observer l’influence de la température sur la structure globale de la protéine en solution : d’une part sur son rayon de giration et sur sa forme, et d’autre part sur les interactions intermoléculaires.
– Influence de la pression sur la structure
Cette étude par diffusion de neutrons aux petits angles s’est poursuivie par l’observation de l’influence de la pression sur la structure globale du BPTI en solution : sur son rayon de giration et sur la forme de la protéine.
Nous avons effectué des expériences complémentaires en spectroscopie optique en l’absence et en présence de rouge Congo et en dérivée 4ème en absorption UV-visible. Elles ont été effectuées en fonction de la température et de la pression afin d’observer l’influence de ces deux paramètres sur les structures secondaires du BPTI. D’autres expériences en infrarouge à transformée de Fourier, sur une solution de BPTI portée à haute température puis refroidie, nous ont permis de mettre en évidence des modifications au niveau des structures secondaires de la protéine.
– Influence de la température sur la dynamique
L’évolution du déplacement carré moyen du BPTI en poudre hydratée a été étudiée en fonction de la température et comparée à celle de la trypsine. L’évolution du déplacement carré moyen du BPTI en solution a aussi été étudiée en fonction de la température en absence et en présence de dénaturant chimique.
Les mouvements de diffusion globale et la dynamique interne du BPTI en solution ont été observés en fonction de la température par diffusion quasiélastique de neutrons. Nous avons décrit les mouvements internes 1) d’une part, à l’aide d’un modèle très simple de diffusion de particules dans une sphère, 2) d’autre part, nous avons obtenu l’évolution des temps de relaxation de ces mouvements en fonction de la température.
– Influence de la pression sur la dynamique
Les mouvements globaux et la dynamique interne du BPTI en solution ont été observés en fonction de la pression par diffusion quasiélastique de neutrons. Nous avons décrit les mouvements internes 1) d’une part, à l’aide d’un modèle très simple de diffusion de particules dans une sphère, 2) d’autre part, nous avons obtenu l’évolution des temps de relaxation de ces mouvements en fonction de la température.

Le pseudo-potentiel de Fermi

Etant donné ses propriétés, le neutron interagit principalement avec les noyaux des atomes et ceci de deux manières différentes : par une interaction nucléaire et par une interaction magnétique. Dans le cas de l’interaction nucléaire, les forces mises en présence agissent sur des distances de l’ordre de grandeur de la taille du noyau, soit 10-4? . De plus la diffusion est isotrope. Le potentiel qui permet de décrire le phénomène de diffusion en tenant compte de ces conditions est le pseudo-potentiel de Fermi : 21 r2h2rs V (r ) = b (r – R ) (1.13) où r définit la position du neutron, Ri la position du noyau et bi est la longueur de diffusion ou longueur de Fermi de l’espèce i.

diffusion cohérente et diffusion incohérente

Le pseudo-potentiel de Fermi V (rr) ne dépend que de la longueur de diffusion bi correspondant au terme f (k , k ‘ ) dans l’équation (1.8) caractérisant l’interaction neutron – noyau. Cette longueur de diffusion est caractéristique de chaque noyau et de chaque isotope d’un même élément.

La longueur de diffusion b est une grandeur indépendante de l’énergie du neutron mais qui varie en fonction du spin total du système constitué par le neutron et le noyau atomique1. Le signe et la valeur de b varient de manière irrégulière en fonction du nombre atomique Z et de la masse atomique A. La partie imaginaire représente l’absorption, elle est souvent négligeable.

Comme le neutron peut avoir deux états de spin, (+ ½ ou – ½ ), un diffuseur de spin non nul, s, possède donc deux longueurs de diffusion différentes, b+ et b-, correspondant aux états (s = + ½ ou s = – ½) du système qui apparaissent de manière aléatoire. Il en résulte que la diffusion d’un neutron par un noyau atomique de spin S ¹ 0 peut être caractérisée par une longueur de diffusion cohérente, bcoh, et une longueur de diffusion incohérente, binc telles que : bcoh = bi (1.14) où < bi > est la moyenne sur toutes les orientations possibles des spins nucléaires et sur les distributions éventuelles des isotopes i.

Pour être vraiment rigoureux dans la définition de la longueur de diffusion cohérente bcoh, il faut prendre en considération la probabilité pour le spin du noyau de l’élément diffuseur soit dans l’état s = + ½ ou s = – ½. En fait, cette probabilité est s1 pour s = + ½ 2s1 etspour s = – ½.Par conséquent : 2s1b bs1bsb(1.15)

La longueur de diffusion varie donc d’un isotope à l’autre, et dépend de l’orientation du spin nucléaire, le neutron ne voit donc pas un potentiel de diffusion uniforme mais un potentiel qui change d’un atome à l’autre. Seul le potentiel moyen, proportionnel à <bi>, peut donner des effets d’interférence et donc une diffusion cohérente. L’écart par rapport au potentiel moyen est distribué de manière aléatoire et ne peut donner aucun effet d’interférence. Il conduit alors à une diffusion incohérente qui est proportionnelle à la déviation quadratique moyenne (<bi²> – <bi>²).

Formalisme de la diffusion aux petits angles

Diffusion par une solution idéale de macromolécules identiques

L’étude des changements structuraux d’une macromolécule biologique entre l’état natif et les états dénaturés a été suivie par différentes techniques dont l’infrarouge, le dichroïsme circulaire et la diffusion de neutrons aux petits angles. Une molécule peut adopter toutes les orientations possibles lorsqu’elle est en solution5 la diffusion de neutrons aux petits angles permet de déterminer sa taille et sa forme et, dans certains cas, sa structure interne.

Considérons un ensemble N de macromolécules en solution. Comme elles peuvent y prendre toutes les orientations possibles, la diffusion est dite isotrope. Si le solvant est constitué de molécules de taille bien plus petite, il peut être considéré comme un milieu continu. Dans l’hypothèse d’une solution monodisperse idéale, c’est-à-dire pour laquelle les particules sont identiques et sans interactions, le soluté produit, par rapport au solvant, un excès de diffusion cohérente : I coh (q) cM K 2 P(q) (1.30)

où c est la concentration des macromolécules, M la masse molaire d’une macromolécule, NA est le nombre d’Avogadro. 29 v protéine _ K est le contraste moyen de la molécule (par exemple une protéine) par rapport au solvant : K åbi ( protéine ) bD2O_M protéine*D2O iM D O 2* v protéine *(1.31) Où : S bi (protéine) est la somme des longueurs de diffusion cohérente des atomes de la protéine (en cm), bD2O est la longueur de diffusion cohérente de l’eau lourde (en cm).

Il s’agit de déterminer le contraste entre la densité de longueur de diffusion du soluté et celle de l’ensemble des molécules de solvant occupant le volume équivalent à celui de la protéine : dans notre cas, le soluté est la molécule de protéine et le solvant est le tampon. Dans le cas de la diffusion des neutrons par des protéines hydrogénées, le contraste est maximal quand le solvant est constitué à 100% d’eau lourde. bD2O = 1.92*10-12 cm. est le volume spécifique de la protéine (en cm3.g-1),

M protéine est la masse molaire de la protéine (en g.mol-1), et M D2O est la masse molaire du solvant (en g.mol-1), M D2O = 20 g.mol-1.

Cas de la diffusion par un mélange de macromolécules identiques en solution diluée.

Nous avons vu jusqu’à présent le cas simple de l’intensité diffusée par une solution idéale de particules identiques.

Dès lors où les échantillons sont soumis à des conditions de dénaturation, Il faut considérer au moins deux populations : la protéine native et la protéine complètement dépliée, et éventuellement des protéines dans des états intermédiaires. Les expressions de l’intensité diffusée doivent prendre en compte ces populations ; l’intensité diffusée s’écrit alors sous la forme : I(q)= fiIi (q), (1.36)

Où les termes fi(q) sont les fractions des différentes populations, et les Ii(q) les intensités de diffusion correspondantes.

Les quantités mises en jeu ci-dessus sont dépendantes du paramètre de dénaturation, par exemple la température T.

L’équation(1.36) peut être réécrite sous la forme : I(q,T)= fi(T) Ii(q,T),(1.37)

La détermination des courbes expérimentales I(q,T) mesurées pour différentes valeurs du paramètre T permet d’obtenir des informations sur la structure des différents états en présence, à condition de séparer l’effet dû à la température dans les courbes de diffusion Ii(q,T) de chacune des populations, c’est à dire à condition de mettre Ii(q,T) sous la forme : Ii(q,T) = Ki(T, vpi)Pi(q), (1.38)

où Pi(q) est le facteur de forme et Ki(T, vpi,) le terme de contraste.

Par conséquent, l’expression (1.37) devient : I(q,T)= fi(T) Ki(T, vpi)Pi(q) (1.39)

Si on suppose que les volumes spécifiques des différentes espèces ont des valeurs suffisamment proches pour que le terme de contraste puisse être considéré comme dépendant seulement de T, l’équation (1.39) devient : I(q,T)/ I(0,T) = fi(T) Pi(q), (1.40)

Le carré du rayon de giration mesuré à la température T est donc : Rg2 (T ) å f i Ri2 (T ) , (1.41) où Ri est le rayon de giration de l’espèce i.

Facteurs de forme des chaînes polymériques

Pour un objet étendu (comme une protéine dénaturée), le domaine de validité de l’approximation de Guinier est tellement réduit qu’il est alors nécessaire de faire appel à une autre approximation (Debye).

Une protéine totalement dépliée peut être considérée comme un polymère dont les monomères sont les acides aminés constituant la chaîne polypeptidique, il est alors possible d’utiliser la théorie des polymères7 afin de décrire le comportement de cette chaîne car le spectre de diffusion d’une solution de protéines totalement dépliées est semblable à celui d’une solution diluée de polymères.

Dans ce paragraphe nous résumons quelques résultats de la théorie des polymères concernant en particulier le facteur de forme P(q).

Nous rappelons quelques concepts de base sur les polymères :

Un homopolymère est une molécule linéaire formée d’une série d’éléments chimiques identiques, les monomères. Un polymère en solution peut se comporter de différentes manières selon le type de solvant dans lequel il se trouve8.

– si les interactions polymère-polymère sont équivalentes aux interactions polymère-solvant, le polymère se trouve en solvant. Il peut adopter toutes les conformations statistiquement possibles et la distribution des monomères est gaussienne. Il se comporte alors comme une chaîne gaussienne ou idéale ;

– dans le cas où les interactions polymère-solvant sont privilégiées, le polymère est totalement solvaté. Le polymère se trouve alors en bon solvant et ne peut plus adopter toutes les conformations qu’il aurait en solvant. Il se comporte alors comme une chaîne à volume exclu.

– dans le cas où les interactions intramoléculaires sont privilégiées, le polymère se trouve en mauvais solvant. Il adopte alors une conformation effondrée plus ou moins compacte.

Une protéine est un hétéropolymère dont les monomères sont des résidus d’acides aminés. Nous pouvons considérer qu’en bon solvant les différences entre les divers résidus sont marginales et une protéine se comportera comme une chaîne à volume exclu. Par contre au voisinage du point et surtout en mauvais solvant, des interactions préférentielles entre certains résidus apparaîtront et la protéine ne se comportera plus comme un homopolymère.

Loi de Debye

Le modèle gaussien est mathématiquement le modèle le plus simple. Une expression analytique, qui décrit le profil de diffusion pour une chaîne gaussienne a été déterminée par Debye9 :

Cette loi permet de déterminer le rayon de giration dans un domaine de vecteur de diffusion qui satisfait la relation qRg<3. Le facteur de forme P(q) est donné par l’expression : P (q) 2 [x1 exp(x)] (1.42) D x 2 où x (qRg)2.

Cette loi peut également être appliquée pour déterminer le rayon de giration, pour des configurations à volume exclu10, puisque dans la zone de q explorée le comportement de la chaîne étendue par rapport à son solvant ne modifie pas l’allure de la courbe de diffusion.

Chaîne à longueur de persistance

Lorsque q ³ 3(Rg)1 la fonction de Debye9 ne donne pas une représentation correcte du spectre de diffusion d’une chaîne polymérique réelle. Les modèles qui permettent de décrire la conformation moyenne d’une telle chaîne se classent naturellement en fonction de la résolution spatiale, q1.

A haute résolution, où les détails de la conformation et de la structure se révèlent, il est nécessaire de tenir compte des interactions existant entre différentes parties de la chaîne :

– les interactions à longue distance sont dues aux effets de volume exclu.

– En revanche, les interactions à courte distance résultent essentiellement d’un effet stérique, qui est la restriction à la rotation autour des liaisons de la chaîne principale.

La chaîne présente une rigidité locale qui est représentée par la longueur statistique b. La longueur statistique est la longueur minimale d’un segment dont l’une des extrémités peut prendre toutes les orientations possibles par rapport à l’autre. Elle permet de distinguer les polymères rigides des polymères flexibles à l’aide du rapport b/L, où L est la longueur de contour du filament. Une chaîne flexible correspond à b/L <<1 et une chaîne rigide à b/L >>1.

Si des Cloiseaux11 en 1973 a donné une expression du facteur de forme d’une chaîne semi-flexible infiniment longue (L/b ® ¥), l’expression de Sharp et Bloomfield12 : b é47æ117 öù PSB (x) = PD (x) + ê + – ç + ÷exp(-x)ú (1.43) où PD(x) est la fonction de Debye, x = q² Lb/6, est plus appropriée pour décrire une chaîne de longueur finie, comme une protéine dénaturée. Cependant ce résultat n’est valable que pour une chaîne idéale telle que L/b > 10 et qb < 3,1.

Le rayon de giration de la chaîne à longueur de persistance a été calculé par Benoit-Doty13 : 36 é y111ù Rg2= b²ê-+-1 – exp(-2 y)ú 644 y8 y² ëû(1.44)

Lorsque qb > 3,1 les difficultés théoriques deviennent trop importantes pour obtenir directement le facteur de forme d’une chaîne semi-flexible de longueur finie. En utilisant la méthode de Monte Carlo, Pedersen et Schurtenberger14 ont d’abord simulé les spectres de diffusion de telles chaînes, avec et sans volume exclu. Ils ont ensuite représenté les résultats des simulations par diverses expressions analytiques qui peuvent être utilisées pour interpréter les spectres expérimentaux. Les fonctions de diffusion sont approchées, aux petites valeurs de q, avec une chaîne gaussienne ou une chaîne à volume exclu, et se superposent avec une expression pour un cylindre pour les valeurs de q plus grandes. Avec ce modèle il est possible d’étudier la zone de q intermédiaire (1/Rg<q<1/a avec a la taille caractéristique d’un centre diffuseur), qui nous permet de mieux caractériser la conformation de la chaîne.

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
I. Introduction à la technique de diffusion de neutrons
A. propriétés du neutron
B. Principe de la diffusion de neutron
1. le phénomène de diffusion
2. notion de vecteur de diffusion
3. Le pseudo-potentiel de Fermi
4. diffusion cohérente et diffusion incohérente
5. diffusion aux petits angles
6. Diffusion incohérente inélastique des neutrons.
7. Formalisme de la diffusion aux petits angles
a) Diffusion par une solution idéale de macromolécules identiques
(1) Approximation de Guinier : rayon de giration
(a) L’intensité à l’origine
b) Cas de la diffusion par un mélange de macromolécules identiques en solution diluée
(1) Facteurs de forme des chaînes polymériques
(2) Loi de Debye
(3) Chaîne à longueur de persistance
c) Représentation de Kratky
d) Effet des interactions
e) Correction du facteur de forme par la concentration
8. Etude de la dynamique
a) Séparation des mouvements
(1) Facteur de structure dynamique incohérent dans le cas d’une seule espèce globulaire en solution
(a) Diffusion quasi-élastique
(b) Mouvements d’ensemble de la protéine
(c) Mouvements internes de la protéine
(2) Expression finale du facteur de structure dynamique incohérent
b) Analyse des données de diffusion quasiélastique de neutron par des modèles d’exponentielles
(1) Le modèle d’exponentielle simple
(2) Le modèle d’exponentielle étirée
(3) Le modèle de la somme d’exponentielles
(4) Définition de l’EISF
(5) Détermination expérimentale
9. Les spectromètres
a) Grandeurs caractéristiques
(1) Gamme en Q
(2) Gamme en énergie–résolution
b) Traitement des spectres
c) Spectromètre à temps de vol
d) Spectromètre à retrodiffusion
e) Modèle d’analyse
(1) Les mouvements dans les protéines
(2) Diffusion dans une sphère
(3) Résolution expérimentale
(4) Discussion du modèle
III. Influence de la température et de la pression sur la structure du BPTI. Une étude par diffusion de neutrons aux petits angles et par spectroscopie UV-visible
A. Matériel et méthode
1. Préparation des solutions et spectromètres de DNPA.
B. Appareillage
C. Traitement des données expérimentales
1. Expression de l’intensité diffusée
2. Traitement des spectres bruts
3. Calibration absolue
4. Bruit de fond incohérent
D. Résultats des expériences de diffusion de neutrons aux petits angles
1. Caractérisation de l’état natif. Facteur de forme théorique.
2. Caractérisation de l’état natif. Etude par diffusion de neutrons aux petits angles
3. influence de la température sur le rayon de giration et les interactions
a) A température ambiante : caractérisation de l’état natif du BPTI en solution
b) Evolution du rayon de giration et des interactions en fonction de la température
c) Evolution de la forme de la protéine en fonction de la température
4. Etude de l’influence de la pression sur la structure du BPTI
a) Influence de la pression sur le rayon de giration du BPTI et sur l’intensité lorsque q tend vers 0
b) Influence de la pression sur la forme du BPTI
(1) Résultats
(2) Discussion
E. Résultats des expériences par spectroscopie UV-visible
a) Mise en évidence de la b agrégation par la fixation de Rouge Congo
(1) Conditions expérimentales
(2) Résultats
(3) Discussion
b) Expériences par Absorption UV-visible en dérivées 4ème
(1) Conditions expérimentales
(2) Résultats
(3) Discussion
F. Conclusion sur l’influence de la température et de la pression sur la structure du BPTI en solution.
CONCLUSION GENERALES ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE