Préparation des solutions d’étalonnage

Préparation des solutions d’étalonnage

Le cannabis et les cannabinoïdes

Le cannabis est un genre botanique qui rassemble les plantes de la famille des Cannabaceae. De nombreux principes actifs sont présents comme des cannabinoïdes, terpénoïdes (Ross and ElSohly 1996), flavonoïdes (Vanhoenacker et al. 2002) et alcaloïdes (Turner et al. 1976). Les cannabinoïdes sont une classe de terpène phénolique uniques de la plante de Cannabis, se trouvant principalement dans les trichomes (Kim and Mahlberg 1997) de la plante (fines excroissances ou appendices). Des 80 et plus cannabinoïdes isolés de la plante de C. sativa (Elsohly and Slade 2005) le Δ9-tétrahydrocannabinol (THC) est celui qui possède les propriétés psychoactives les plus importantes, en plus d’être le cannabinoïde le plus abondant dans la plante de Cannabis.
Le cannabis est de loin la substance la plus consommée parmi les substances illicites en Suisse, et ceci malgré le fait que la loi sur les stupéfiants en interdise la consommation. En 2012 29.5% de la population Suisse entre 15 et 49 ans déclarait avoir déjà essayé du cannabis au moins une fois dans leur vie. Ce pourcentage est en constante augmentation depuis 1997, passant de 18.9% en 1997, à 20.9% en 2002 et à 25.5% en 2007 (Office fédéral de la statistique 2014).
La consommation de cette drogue, outre les problèmes de santé, est problématique aussi pour la circulation routière. En effet, comme tant d’autres, elle altère le jugement et les reflex du consommateur (Sewell, Poling, and Sofuoglu 2009) en le rendent inapte à la conduite. La loi suisse fixe à 1.5 µg/L la limite de THC admise dans le sang pour les conducteurs (« Legge federale sugli stupefacenti e sulle sostanze psicotrope » 1951).

Le cannabigerol

Le cannabigerol est un cannabinoïde non psychoactif présent en faible quantité dans la plante de cannabis. Le cannabigerol en un précurseur à court terme du THC et du CBD, ce qui explique sa basse concentration dans la plante qui est de l’ordre de 10% des cannabinoïdes totaux (Meijer and Hammond 2005). Le cannabigerol inhibe directement la production de PGE2, l’enzyme PLA2 et de manière non spécifique l’enzyme COX. Ceci confère à ce cannabinoïde une propriété antiinflammatoire utilisé depuis des millénaires en médecine traditionnelle et récemment en médecine classique.
Comme d’autre pythocannabinoïdes le CBG s’est montré efficace dans la réduction de la prolifération de plusieurs ligné de cellules cancérogènes, comme celles du cancer du sein, de la prostate et du tract colon-rectal (Ligresti et al. 2006). Malgré le fait que son efficacité ait été prouvée les mécanismes d’actions restent pour le moment inconnu.

Le cannabidiol

Le cannabidiol est un métabolite non psychoactif de la plante de cannabis. Il possède des propriété sédative, hypnotiques, anticonvulsif et antioxydantes. Pour ce qui concerne la sclérose en plaques deux modèles animaux ont été étudiés ; EAE et TMEV. Il a été démontré que le cannabidiol améliore la symptomatologie des deux modèles animaux en diminuant l’inflammation et l’activité microglial.
A l’heure actuelle, en Suisse il existe 3 médicaments sous prescription contenant du cannabidiol, le Sativex®, Cesamet® (Nabilone) et Marinol® (dronabinol). Comme pour le CBG la quantification du cannabidiol à uniquement un intérêt médical.

Stratégie de quantification

La quantification de cannabinoïdes dans le sang complet est un grand défi dicté avant tout par la très basse limite de quantification imposée par la loi (1.5 µg/L) et surtout par la matrice complexe qui est le sang. Dans la littérature la quantification de cannabinoïdes est usuellement effectuée dans du plasma ou du sérum, des matrices beaucoup plus propres en termes d’impureté qui pourraient gêner la détection par spectre de masse. Les appareils usuellement utilisés sont le LC-MS ou le GC-MS, qui permettent d’atteindre une sensibilité très basse. Le choix du GC-MS a été imposé par l’hôpital, ayant uniquement cet appareil à disposition pour les analyses sur le sang.
Pour ce qui concerne la préparation de l’échantillon celle-ci se déroule en trois étapes :
Séparation liquide-liquide : pour précipiter les globules rouges et autres cellules présentes dans le sang.
Extraction en phase solide (SPE) : pour séparer les cannabinoïdes des autres composés encore présents dans l’échantillon et pour finir une.
Dérivatisation : indispensable pour rendre les cannabinoïdes volatiles et donc analysable par GC.
Pour améliorer la sensibilité de la méthode et éviter un bais induit par le rendement de l’extraction sur colonne (SPE) un standard interne deutéré est ajouté pour chacune des substances. Ce standard interne, dont la concentration est la même pour chaque échantillon, contrôle et étalon, sert aussi à identifier les pics lors de concentration très basse, car le temps de rétention est très proche et la concentration utilisée est assez haute pour être visible avec simplicité.

Le test à écoulement latéral Nal von Minden

Le DrugScreen® rapid test de Nal von Minden GmbH est un test de dépistage rapide de drogues basé sur des échantillons d’urines. Le test nécessite 3 gouttes d’urines et est capable en 5 minutes de relever la présence de 11 drogues différentes ; amphétamines, benzodiazépines, cocaïne, ecstasy, opiacés, méthadone, oxycodone (analgésique), paracétamol, cannabinoïdes, tramadol (antalgique) et zolpidem (hypnotique). Ce test a une basse spécificité par rapport à d’autres tests rapides (DrugWipe®, RapidSTAT® ou DrugTest®) mais est l’un des meilleurs en termes de détection de THC-COOH (Musshoff et al. 2014). Le cut-off pour les cannabinoïdes est de 50 ng/mL.
Le but du travail sur le DrugScreen® est de montrer la spécificité et la sensibilité du test concernant le cannabis pour l’étude Faber.
L’étude Faber est une étude sur la fertilité masculine en Suisse qui, dans le cadre du Programme national de recherche « Perturbation endocriniens : importance pour les êtres humains, les animaux et les écosystèmes », se concentre sur l’impact de l’environnement sur la fertilité et le système reproducteur masculins en Suisse. Pour cette étude les données de 3’000 volontaires ont été récoltées par le biais du Service Médico-militaire lors du recrutement (Fondation Faber 2005).

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Table des matières

1 Introduction
1.1 Le cannabis et les cannabinoïdes
1.2 Le cannabigerol
1.3 Le cannabidiol
1.4 Stratégie de quantification
1.5 Le test à écoulement latéral Nal von Minden
2 Matériels et méthodes
2.1 Réactifs
2.2 Matériel et appareillage
2.3 Méthode
2.3.1 Préparation des solutions d’étalonnage
2.3.2 Procédure d’étalonnage
2.3.3 Contrôle de qualité interne
2.3.4 Préparation des échantillons
2.3.5 Extraction liquide-liquide
2.3.6 Extraction liquide-solide
2.3.7 Dérivatisation
2.3.8 Méthode GC-MS pour la quantification
2.3.9 Statistique
3 Résultats
3.1 Méthode initiale
3.2 Choix de l’agent de dérivatisation
3.3 Amélioration de la méthode GC
3.4 Choix des masses
3.5 Choix du volume d’injection
3.6 Amélioration de l’extraction en phase solide
3.7 Validation
3.7.1 Sélectivité
3.7.2 Spécificité
3.7.3 Linéarité
3.7.4 Justesse
3.7.5 Précision
3.7.6 Limite de quantification
3.7.7 Effet mémoire
3.7.8 Limite de détection est stabilité
3.8 Deuxième validation
3.8.1 Linéarité
3.8.2 Justesse
3.8.3 Précision
3.8.4 Limite de quantification
3.9 Nal von minden
4 Discussion
4.1 Validation
4.2 Tests à écoulement latéral Nal von Minden
5 Conclusions et perspectives
6 Remerciements
7 Bibliographies
8 Annexes