PREPARATION DE PROTEINES RECOMBINANTES

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Les protéines liant les dinucléotides (ou « Rossman fold »):

Cette famille comprend les protéines liant le « Nicotinamide Adenine Dinucléotide » (NAD), et est caractérisée par la séquence consensuG-X-G-X2-G. Le cœur structural de ces protéines est généralement composé de six brinsβparallèles connectés par des hélicesα, des brins β, ou des boucles irrégulières.

Les protéine kinases

Elles constituent la plus large classe des protéines liant les nucléotides et jouent un rôle décisif dans la régulation de nombreux processus biologiques, tels que la différenciation ou la transduction de signaux.
Une partie des protéine kinases catalysent le transfert du phosphate γ de l’ATP sur le groupement hydroxyle des chaînes latérales des acides aminés hydrophiles ou aromatiques. La plupart contiennent douze séquences consensus, dont un motif riche en glycines de séquenceG-X-G-X2-G, formant une boucle flexible, et leur classification est donc basée sur leur spécificité (Vetter and Wittinghofer, 1999) :
– Les kinases à sérine et thréonine.
– Les kinases à tyrosine.
– Les kinases doubles qui catalysent le transfert du phosphate sur les deux types d’hydroxyles des chaînes latérales (sérine/thréoninou tyrosine).
De nombreuses structures de protéine kinases à sérine, thréonine ou tyrosine ont été résolues montrant que toutes possèdent un repliement commun caractérisé par deux lobes. Le premier lobe, principalement constitué de brins β, contient les éléments de séquences impliqués dans la fixation de l’ATP, avec la boucle riche en glycines. Le second lobe, plus large, est composé d’hélicesα, et contient une boucle catalytique importante pour le transfert du phosphate et une boucle régulatrice impliquée dans la régulation de l’activité catalytique.
Curieusement, certaines protéine kinases bactériennes, dont le repliement tertiaire est différent des protéine kinases eucaryotes, appartiennent à la famille des NTPases à P-loop car elles possèdent, entre autres, la séquence consensu G/A-X4-G-K-T/S. C’est le cas, par exemple, de l’HPr kinase/phosphatase qui partage des homologies structurales avec une kinase de petite molécule, la phosphoénolpyruvate arboxykinasec (Fieulaine et al., 2001; Galinier et al., 2002), ou encore de tyrosine kinases capables d’autophosphorylation détectées chez plusieurs bactéries et notamment celle de Staphylococcus aureus qui serait apparentée à une protéine du groupe SIMIBI (voir chapitre I-B-2a) (Grangeasse et al., 1997; Soulat et al., 2006), mais aussi de PrkA, une kinase à sérine/thréonine de B. subtilis (Fischer et al., 1996).

Les Histidine kinases/HSP90/Topoisomérase II

Elles sont caractérisées par un feuilletβ contenant huit brins le plus souvent antiparallèles et par une région en hélicesα. Cette famille regroupe une autre catégorie de protéine kinases, différentes d’un point de vue structural et fonctionnel de celles décrites ci-dessus. Ces kinases phosphorylent des histidines, et leur cœur structur al possède des similarités avec la protéine Hsp90 ou avec des topoisomérases II (Vetter and Witinghofer, 1999).

La famille des Actines/HSP70/RNAse H

Elles sont caractérisées par un feuilletβ contenant cinq brins, le brin 2 étant antiparallèle au reste du feuillet, et par deux régions en hélices α.

Evolution et hypothèse d’un ancêtre commun

Les protéines sont construites à partir d’un nombre limité d’éléments architecturaux, et la plupart d’entre eux sont impliqués dans le repliement général de la protéine. D’autres motifs ont une activité catalytique ou un rôle dans la liaison d’un ligand. La présence de ce type de motif dans les protéines nouvellement découvertes et de fonction inconnue, peut indiquer une fonction putative. Dans ce contexte, les séquences présentes chez les protéines liant les nucléotides ont attiré l’attention des chercheurs.
De tels motifs fonctionnels peuvent être caractéristiques de superfamilles de protéines qui ont divergées à partir d’un ancêtre commun, puis qui ont perdu leur ressemblance à l’exception des régions fonctionnelles les plus importantes. Onparle alors d’évolution divergente. D’un autre coté, ces motifs peuvent refléter une évolution convergente, c’est-à-dire qu’ils sont apparus dans des protéines non apparentées parce qu’ils représentaient une solution unique à un problème.
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Rappels bibliographiques
Il est difficile de faire la distinction entre divergence et convergence et de nombreux débats et désaccords sur l’évolution des NTPases àP-loop existent. A l’exception de la P-loop, le reste de la structure des protéines est assez variable. Leur seul trait commun est la présence d’un corps structural α/β contenant plusieurs brins β qui alternent avec des hélicesα. Des auteurs ont prouvé que ce cœur α/β représentait un élément structural conservé au cours de l’évolution pour la liaison des nucléotides, mais qui a subit de nombreux changements. Ce motif fut appelé « coeur structural ancestral » (Milner-White et al., 1991) ou encore « repliement classique des protéines liant les mononucléotides » (Schulz, 1992), et renforce l‘hypothèse que les protéines à P-loop descendent d’un ancêtre commun.
Non seulement les topologies observées chez les protéines à P-loop sont différentes, mais le mécanisme de transfert du phosphate et la nature de la réaction catalysée varient considérablement entre les différentes familles.
Les nucléosides monophosphate kinases, comme l’adenylate ou l’uridylate kinase catalysent le transfert direct du phosphate de l’ATP à l’AMP o u à l’UMP, respectivement. Elles possèdent un grand nombre de résidus arginine qui,avec la lysine conservée de la P-loop, vont stabiliser les charges négatives du phosphate .Il a été montré que ces arginines jouent un rôle très important dans la catalyse (Tsai and Yan, 1991; Yan et al., 1990).
Les ATPases et GTPases catalysent l’hydrolyse de la liaison ester entre les phosphates β et γ du nucléotide. Chez les ATPases, un résidu glutamate active une molécule d’eau proche du phosphate γ, ce qui entraîne l’attaque nucléophile du phosphate γ. Mais certaines ATPases, comme la nitrogénase, utilisent un aspartate comme base catalytique et d’autres, comme la myosine, ne possèdent pas de résidus acides. Dans ec cas précis, le mécanisme d’hydrolyse reste flou. Aucun résidu, agissant comme base catalytique en activant une molécule d’eau, n’a été trouvé chez les GTPases TRAFAC, et il a été poséro que le phosphateγ agit lui-même en temps que base (Schweins et al., 1996; Schweins et al., 1995). La plupart de ces protéines montrent une activité catalytique très faible car un second composant (GAP), fournissant un résidu arginine dans le site actif, doit être ajouté en trans pour compléter le site actif et accélérer la réaction. Ces exemples démontrent qu’un mode similaire de liaison du nucléotide n’implique pas forcément un mode similaire de mécanisme de réaction.
Pour conclure, il n’existe pas de modèle qui identifie toutes les NTPases à P-loop. Le modèle diffère légèrement d’une famille à une autre, mais également au sein d’une même famille. On suppose que ces protéines ont évoluéesindépendamment et plus d’une fois, et même lorsqu’elles semblent provenir d’un ancêtre commun, des changements significatifs ont pu apparaître avec le temps.

OLIGOMERISATION

Les interactions entre protéines sont la base de lastructure quaternaire des complexes protéiques et représentent l’un des niveaux les plus subtils de l’organisation structurale des molécules biologiques. Leur importance est reflétéepar l’abondance de la littérature produite dans le domaine de l’association des protéines (Jaenicke and Lilie, 2000; Jones and Thornton, 1995; Park et al., 2001).
Les protéines multimériques constituent seulement nu système parmi tous les complexes protéiques existants tels que l’interaction d’une protéine avec un inhibiteur, d’une protéine et son ligand, ou encore d’une protéine avec un autre partenaire cellulaire protéique (voies de signalisation). Ces différents systèmes représentendifférents niveaux d’interactions, et les interactions entre les sous-unités d’un multimère sont parmi les plus fortes.
La surface extérieure d’un monomère affiche des détails structuraux qui permettent une disposition dans un ordre spécifique, formant ainsi un oligomère. Ces derniers ont évolué pour acquérir des bénéfices tels que la réductione dla région en surface, l’augmentation de la stabilité, et de nouvelles fonctions à travers la communication entre sous-unités. Ainsi ils exercent une pression de sélection forte pour l’évolution des protéines monomériques en complexes oligomériques.
Les interactions mises en place aux interfaces entraînent, d’un protomère à un autre, un effet de contrainte qui modifie la structure et donc les propriétés fonctionnelles de l’autre protomère : c’est le fondement de nombreux phénomènes cellulaires tels que la transduction du signal, ou la coopérativité enzymatique. Toutesces interactions ne reposent pas sur de solides liaisons covalentes, mais sur l’ensemble des liaisons faibles qui peuvent unir deux chaînes polypeptidiques. Ces liaisons, bien qu’énergétiquement plus faibles que les liaisons covalentes, sont d’une importance capitale pour les processus biologiques : leur effet cumulatif maintient l’état oligomérique des macromolécules, et inversement, la facilité qu’ont ces forces à se rompre confère toute la souplesse et la dynamique conformationnelle nécessaire aux protéines. Tout ceci est compatibleavec la chimie de la cellule où les propriétés de la vie découlent des interactions moléculaires : les biomolécules s’assemblent, puis se dissocient.
En approfondissant nos connaissances sur les interfaces dimériques, on peut ainsi espérer découvrir des molécules qui perturbent la imérisationd de protéines dont la fonction est essentielle à la viabilité des cellules. Ainsi, la caractérisation et la compréhension des interactions entre protéines sont une étape préliminaire à la conception de nouvelles drogues antibactériennes (Jones and Thornton, 1995).

Les interactions mises en jeu à l’interface d imérique

Ces liaisons, illustrées par la figure 7, sont de différentes natures. La force du type de liaison à établir va conditionner la distance à laq uelle les atomes concernés vont devoir être positionnés (quelques angströms).
Interactions de type van der Waals
Ces forces apparaissent entre tous les atomes neutres à l’occasion d’interactions électrostatiques transitoires. Elles sont en général de très faible intensité, et diminuent rapidement avec la distance. Elles proviennent de dipôles produits dans les atomes par mouvements des électrons autour de leur noyau chargé positivement, et représentent donc l’attraction électrostatique entre le noyau d’un atome et les électrons d’un autre. Il est intéressant de noter que ce sont ces dipôles transitoires qui constituent l’essence de l’effet hydrophobe.
Liaisons hydrogène
La liaison hydrogène est une liaison faible à caractère essentiellement électrostatique, liant un atome électronégatif doté d’un doublet libre à nu atome d’hydrogène, lui-même covalemment lié à un autre atome. Les atomes reliés par les liaisons hydrogène sont essentiellement l’oxygène et l’azote. L’énergie de la liaison hydrogène est en moyenne d’environ 5 kcal/mol, suffisamment faible pour êtrefacilement réversible mais suffisamment élevée pour avoir des conséquences importantes.
Interactions ioniques
Les liaisons électrostatiques, interactions les plus fortes parmi les liaisons non covalentes, sont dues aux charges électriques des radicaux desacides aminés. Dans les protéines, il existe différents groupes chargés positivement (amide enN-terminal, chaîne latérale de la lysine, de l’arginine et de l’histidine) et négativement (carboxyl C-terminal, chaîne latérale de l’aspartate et du glutamate). Il se forme alors des forces d’attractions entre deux atomes proches dans l’espace et de charges opposées, qui vont leur permettre de former un pont salin.
Les ponts disulfures
A la différence des autres liaisons, un pont disulfure (lien S-S) est un lien covalent fort qui, par oxydation, réunit les fonctions thiols de deux cystéines. La molécule résultante de la liaison de deux cystéines est la cystine. Ces interactions sont plus rares chez les protéines bactériennes compte tenu, d’une part, de la faible abondance des cystéines au sein des protéines et, d’autre part, du milieu bactérien réducteur défavorable à leur formation.
1- Interaction électrostatique.
2- Liaison hydrogène.
3- Pont disulfure.
4, 5- Liaison de van der Waals.

Définition d’une interface d’interaction

Une interface d’interaction possède des caractéristiques structurales et chimiques particulières, qui diffèrent d’une protéine à l’autre. Pour déterminer une interface, les premières approches consistent à répertorier et comparer les nombreuses interactions à partir des bases de données, puisque la prédiction des interactions n’est pas encore mise au point. En effet, il existe des méthodes informatiques qui consistent à déterminer le meilleur appariement possible entre deux molécules, où l’ajustement géométrique et la prise en compte des énergies doivent être utilisés pour l’obtentiond’un positionnement correct des deux molécules. Cependant, les auteurs montrent que les modèles les plus proches des structures cristallographiques ne correspondent pas toujours aux solutions dont le score est le plus important. Par conséquent, ces méthodes, bien que rometteuses,p devront encore subir de nombreux développements afin d’accroître leur efficacité. Le dépôt des structures tridimensionnelles dans les banques de données de protéines a permis l’analyse d’un large nombre de protéines multimériques. Une étude réalisée sur 23 protéines oligomériques montre une gamme de tailledes interfaces très étendue (Janin et al., 1988). Elle constitue en moyenne 20 % de la surface accessible totale, et augmente à la fois en fonction de la taille des sous-unités et du degré ’oligomérisationd. Un des aspects principaux dans la stabilisation de l’association des protéines est la présence des interactions de van der Waals entre les résidus hydrophobes (Chothia and Janin, 1975). En effet, la plupart des interfaces sont composées de 70 % de résidus non polaires. L’autre aspect fondamental des interactions entre protéines est la complémentarité: complémentarité de formes mais aussi complémentarité électrostatique, les ponts salins t eles liaisons hydrogènes constituant une caractéristique importante des interfaces. D’ailleurs, certains atomes polaires appartenant à l’interface interagissent même grâce à des molécules d’eau intermédiaires situées généralement à la périphérie de l’interface.
La répartition des zones hydrophobes à l’interface a tout d’abord été considérée comme ressemblant fortement à la coupe transversale d’une protéine, avec une région périphérique hydrophile et une région centrale hydrophobe (Miller, 1989). Mais cette observation n’est pas générale puisque une analyseplus récente a montré que la majeure partie des interfaces étudiées montre une dispersion de petites zones hydrophobes entourées de régions polaires (Larsen et al., 1998). Par ailleurs, l’hydrophobicité avait été défini comme étant le facteur majeur de stabilisation de l’association protéine/protéine, alors que les liaisons hydrogènes et les ponts salins jouaient un rôle sélectif en sélectionnant les protéines qui allaient s’assembler (Chothia and Janin, 1975). Mais l’étude de plusieurs complexes hétérologues (Xu et al., 1997) a montré l’importance non seulement des liaisons de type hydrophobe mais aussi des liaisons électrostatiques dans la stabilité du complexe. Cette observation pourrait donc s’appliquer aux interfaces homodimériques où une large interface hydrophobe confèrerait la même stabilité à un oligomère que la collection de petits patchs hydrophobes répartis sur toute l’interface.
En résumé, l’interaction entre deux protéines, différentes ou identiques, est complexe et de nombreux facteurs contribuent à une associati on stable.

Les NTPases qui s’oligomérisent

Les protéines du groupe ASCE

Les ATPases à P-loop actives sous forme  » d’anneau hexamérique »

La plupart des ATPases du groupe ASCE sont capables de former des structures hexamériques en forme d’anneau. Cette structure quaternaire, observée chez les protéines de la famille RecA/F0-F1, les protéines AAA, et certaines hélicases, suggère que c’est un trait ancestral des protéines de ce groupe.
Cette ATPase, active sous forme oligomérique, est capable de former des anneaux hexamériques avec un diamètre optimal de façon à encercler l’ADN (Leipe et al., 2000). Le brin β0 et l’hélice α situés en N-terminal d’un monomère sont empaquetés de façon antiparallèle entre le brin β3 et l’hélice α suivante du domaine α/β de l’autre monomère (Story et al., 1992). Un tel arrangement ajoute une nouvelle unité α/β dans le domaine central de la molécule adjacente, élargissant ainsi le feuilletβ à neuf brins. Ainsi, le signal peut être transmis d’une sous-unité à l’autre lors de la liaison et l’hydrolyse du nucléotide via des changements conformationnels, ce qui affecte l’affinité de la protéine pour l’acide nucléique.
Les protéines AAA
Comme RecA, la majorité des ATPases AAA fonctionnen sous forme de structure en anneau oligomérique, ce qui fournit des surfaces symétriques ou quasi symétriques pour l’interaction avec d’autres molécules ou un pore central à travers lequel peuvent passer l’ADN, l’ARN ou encore des polypeptides (figure 8).
Une arginine conservée, localisée enC-terminal de l’hélice qui suit le brin β5, est dirigée vers le site actif du monomère adjacent dans l’anneau (Iyer et al., 2004; Lupas and Martin, 2002). Elle interagit avec le phosphate γ du nucléotide fixé et peut ainsi transmettre un signal à la sous-unité précédente lors de l’hydrolyse de l’ATP via un mouvement de l’hélice (figure 9). Ce mécanisme pourrait expliquer la nette amélioration de l’activité ATPase dans la forme oligomérique. Ceci a été nommé « arginine finger » par analogie avec le résidu équivalent trouvé dans les complexes [Protéine G GAP]– où l’arginine est apportée en trans par la protéine GAP et joue un rôle critique dans l’hydrolyse. Ce phénomène a d’abord été décrit chez les protéines AAA mais est caractéristique de toutes les ATPases de type « RecA like » qui forment des anneaux hexamériques.
La localisation du site de liaison des nucléotides situés à l’interface des sous-unités a permis à certaines protéines AAA de rendre leur oligomérisation dépendante des nucléotides (Lupas and Martin, 2002).

L’HPr kinase/phosphatase (HprK/P)

Les bactéries sont des organismes hautement adaptatifs, capables de croître dans des conditions environnementales variées. Une des clefs de leur adaptation est la multitude de gènes cataboliques permettant à la bactérie de pousser en présence de différentes sources de carbones. L’HprK/P est une enzyme de régulation qui contrôle le métabolisme du carbone chez les bactéries à Gram positif. Elle catalyse la phosphorylation ATP-dépendante de la sérine 46 de l’HPr, une protéine du système phosphotransférase, mais aussi sa déphosphorylation.
Comme nous l’avons énoncé dans le chapitre I-A, l’HprK/P ne ressemble pas aux protéine kinases eucaryotes puisqu’elle ne possèdepas les signatures typiques trouvées dans cette famille. En revanche, elle possède un motif A de Walker. L’HprK/P de différents organismes a été étudiée. Les domaines putatifs deliaison au nucléotide et à l’HPr sont très conservés dans les différents organismes, et leur tructures tertiaire devrait être la même. En revanche, la structure quaternaire semble beaucoup moins conservée. En effet, les données disponibles suggèrent la présence de dimère chezEnterococcus faecalis (Kravanja et al., 1999), d’hexamère chez Lactobacillus casei (Fieulaine et al., 2001), Staphylococcus xylosus (Marquez et al., 2002), et Mycoplasma pneumoniae (Steinhauer et al., 2002), d’octamère ou d’hexamères chez B. subtilis selon les auteurs (Jault et al., 2000; Ramstrom et al., 2003), ou encore de décamère chez Streptococcus salivarius (Brochu and Vadeboncoeur, 1999). La structure hexamerique est cependant la plus retrouvée. Un équilibre entre dimères et hexamères en fonction du pH a également été décritpour la protéine deB. subtilis (Ramstrom et al., 2003), et la caractérisation de ses propriétés enzymatiques a été exploitée, montrant une forte coopérativité positive pour la liaison du nucléotide et du Fructose 1, 6-bisphosphate (Jault et al., 2000).

Les facteurs agissant sur l’oligomérisation :

La composition saline

L’état oligomérique d’une protéine dépend souvente dla force ionique du tampon dans lequel elle se trouve. Cependant, l’effet des sels sur sa structure quaternaire est différent selon la nature des interactions impliquées à l’interface du multimère. Les interactions électrostatiques sont rompues à des concentrations salines élevées alors que les liaisons de type hydrophobe sont renforcées (Lebowitz et al., 1994). En effet, les résidus chargés d’un monomère vont interagir avec les contre ions des sels (Cl-, Na+, K+ …) et ne vont plus interagir avec les résidus chargés de l’autre monomère alors que les résidus apolaires vont se regrouper entre eux pour éviter toute interactions avec les contre ions chargés. L’addition de sels provoque donc une dissociation du dimère lorsque des interactions électrostatiques sont mises en jeu (Lebowitz et al., 1994) ou, au contraire, une association lorsque des interactions de type hydrophobe sont impliquées (Khayat et al.,2004).

Le pH

Les changements de pH ont une incidence sur les liaisons électrostatiques. L’état d’ionisation de la chaîne latérale des acides aminés acides et basiques dépend de leur pKa et du pH de la solution dans laquelle la protéine se trouve. Le pKa d’un résidu aspartate ou glutamate se situe autour de 4 ou 5, et ceux de l’arginine et la lysine sont d’environ 12,5, et 10,5 respectivement. A pH neutre, la chaîne latérale d’un résidu acide, chargé négativement, pourra alors interagir avec celle d’un résidu basique chargé positivement.
Lorsque le pH de la solution augmente il y a une déprotonation ou à l’inverse une protonation lorsqu’il diminue. Ceci occasionne un changement de charges, qui a une conséquence sur les interactions électrostatiques impliquées dans la dimérisation (Chou et al., 2004; Ramstrom et al., 2003).

La température

Comme pour l’effet de la force ionique, les conséquences de la température sur l’oligomérisation d’une protéine dépendent de la nature des interactions à l’interface du multimère. Ainsi, les interactions de type hydrophobe sont renforcées à températures élevées alors que les interactions électrostatiques sont rompues (Lebowitz et al., 1994).
L’augmentation de température provoque donc une association lorsque des interactions de type hydrophobe sont impliquées ou, au contraire, une dissociation du dimère lorsque des interactions électrostatiques sont mises en jeu.

La concentration protéique

Dans la plupart des cas, il existe une corrélation directe entre la distribution des espèces monomériques et dimériques et la concentration en protéine. Une augmentation de la concentration protéique entraîne un rapprochement des molécules dans l’espace et par conséquent, facilite la multimérisation.

Les substrats

Dans certains cas, la fixation d’un substrat ou d’u n partenaire protéique entraîne ou favorise la multimérisation de la protéine. C’est el cas des protéines SIMIBI dont la dimérisation est médiée par la fixation du nucléoside triphosphate (voir chapitre II-C-2-a), ou encore de l’hélicase Rep dont la dimérisation est épendante de l’ADN.

Les agents réducteurs

Le pont disulfure est une liaison covalente mais qui est facilement rompue en milieu réducteur. Ainsi, des réducteurs doux, tel leβ-mercaptoéthanol (βME) ou le dithiothreitol (DTT), permettent la dissociation d’un oligomère lorsque des ponts disulfures sont impliqués dans l’oligomérisation (Sato et al., 2005).

Table des matières

INTRODUCTION
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I. LES PROTEINES LIANT LES NUCLEOTIDES
I-A. Introduction
I-B. Les NTPases à P-loop
I-B-1. Généralités
I-B-2. Classification
I-B-2-a. Les différentes familles
I-B-2-b. Les groupes KG et ASCE
I-B-3. Evolution et hypothèse d’un ancêtre commun
II-OLIGOMERISATION
II-A. Les interactions mises en jeu à l’interface dimérique
II-B. Définition d’une interface d’interaction
II-C. Les NTPases qui s’oligomérisent
II-C-1. Les protéines du groupe ASCE
II-C-1-a. Les ATPases à P-loop actives sous forme « d’anneau hexamérique »
II-C-1.b. Les transporteurs ABC
II-C-2. Les protéines du groupe KG
II-C-2-a. Les GTPases du groupe SIMIBI
II-C-2-b. L’HPr kinase/phosphatase (HprK/P)
II-D. Les facteurs agissant sur l’oligomérisation :
II-D-1. La composition saline
II-D-2. Le pH
II-D-3. La température
II-D-4. La concentration protéique
II-D-5. Les substrats
II-D-6. Les agents réducteurs
III. VERS DE NOUVELLES CIBLES POUR LA RECHERCHE D’ANTIBIOTIQUES
III-A. La résistance aux antibiotiques, un problème de santé publique
III-A-1. Présentation du problème
III-A-2. Caractéristiques des antibiotiques préexistants
III-A-3. Comment lutter contre l’émergence des souches multirésistantes
III-A-4. Définition de la cible idéale d’un nouvel inhibiteur
III-B. Choix de la cible
III-B-1. Pourquoi une protéine de B. subtilis ?
III-B-2. La protéine YdiB est-elle une cible idéale ?
III-C. Caractéristiques et classification de YdiB
III-C-1. Caractéristiques
III-C-1-a. Au niveau de la structure
III-C-1-b. Au niveau de la séquence
III-C-1-c. Au niveau du génome
III-C-2. Classification et points communs avec les autres NTPases à P-loop
MATERIELS ET METHODES
I. BIOLOGIE MOLECULAIRE
I-A. Conditions de culture
I-A-1. Souches bactériennes
I-A-2. Vecteurs plasmidiques
I-A-3. Milieux de culture
I-B. Techniques de biologie moléculaire
I-B-1. Préparation de l’ADN génomique bactérien
I-B-2. Amplification par PCR
I-B-3. Electrophorèse des fragments d’ADN
I-B-4. Extraction de fragments d’ADN à partir d’un gel d’agarose
I-B-5. Préparation des ADN plasmidiques
I-B-6. Restriction de fragments d’ADN
I-B-7. Ligature des fragments d’ADN
I-B-8. Transformation de bactéries compétentes
I-B-8-a. Perméabilisation de la membrane chez E. coli
I-B-8-b. Electroporation chez E. coli
I-B-8-c. Transformation de B. subtilis
I-B-9. Mutagenèse dirigée
II. PREPARATION DE PROTEINES RECOMBINANTES
II-A. Surproduction des protéines
II-A-1. Surproduction analytique
II-A-2. Solubilisation des protéines
II-A-3. Surproduction préparative de YdiB-(his)6 et des mutants
II-A-3-a. YdiB-(his)6
II-A-3-b. Les mutants
II-B. Purification de YdiB-(his)6 et des mutants
II-B-1. Chromatographie échangeuse d’anions
II-B-2. Chromatographie sur gel de nickel agarose
II-B-3. Précipitation de la protéine par le sulfate d’ammonium
II-C. Dosage des protéines par la méthode de Bradford
II-D. Concentration des protéines
II-E. Clivage des protéines à la thrombine
II-F. Electrophorèse des protéines en conditions dénaturantes
II-G. Détection des protéines par immuno-révélation
II-G-1. Transfert
II-G-2. Immuno-révélation des protéines
II-G-2-a. Anticorps anti-6-histidines
II-G-2-b. Anticorps polyclonaux de lapin anti-YdiB ou anti-YjeE
III. MESURE DE L’ACTIVITE ATPASE
IV. ETUDE DE LA MULTIMERISATION
IV-A. Etude de la multimérisation in vitro
IV-A-1. Ultracentrifugation analytique
IV-A-2. Chromatographie d’exclusion
IV-A-3. Electrophorèse des protéines en conditions natives
IV-B. Etude de la multimérisation in vivo
V. MISE EN EVIDENCE DE L’EXPRESSION ENDOGENE DE YDIB
VI. RECHERCHE DES PARTENAIRES PROTEIQUES DE YDIB PAR LA TECHNIQ DE « PULL-DOWN »
RESULTATS 
I- YDIB EST-ELLE ESSENTIELLE ?
II- CLONAGE ET PURIFICATION
III- YDIB FORME DES MULTIMERES IN VITRO
III-A. Equilibre dynamique entre les différentes formes
III-B. Effet d’agents réducteurs
III-C. Effet des sels sur l’oligomérisation de YdiB
IV- YJEE, L’HOMOLOGUE DE YDIB CHEZ E. COLI, FORME EGALEMENT DES MULTIMERES IN VITRO
V- MULTIMERISATION IN VIVO
VI- ACTIVITES ATPASE DE LA SOUCHE SAUVAGE
VI-A. Caractérisation de l’activité ATPase des espèces monomériques et multimériques
VI-B. Effet des sels sur l’activité enzymatique
VI-C. Dépendance de la concentration en protéine
VI-D. Dépendance de la concentration en ATP
VII- ETUDES DES MUTANTS
VII-A. Le choix des mutations
VII-B. Clonage, expression et purification des mutants
VII-C. Oligomérisation des mutants
VII-D. Activité enzymatique des mutants
VII-E. Complémentation
VII-E-1. Description des souches
VII-E-2. Construction des souches
VII-E-3. Croissance des souches sauvage et mutantes
VIII. RECHERCHE DES PARTENAIRES PROTEIQUES DE YDIB PAR LA TECHNIQUE DE « PULL-DOWN »
DISCUSSION
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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