Préparation de nanoparticules par polymérisation de monomères

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Préparation de nanoparticules à partir de polymères préformés

L’utilisation de polymères préformés comporte certains avantages par rapport à la méthode utilisant la polymérisation de monomères. En effet, les polymères préformés possèdent des propriétés physicochimiques bien définies, et le processus ne nécessite pas une étape d’élimination des monomères résiduels et des réactifs (amorceur, catalyseur, etc.). De plus, il ne peut pas y avoir de réaction avec le principe actif pendant la préparation des nanoparticules. Les principales méthodes utilisant des polymères préformés sont les suivantes :

Emulsion/évaporation de solvant

Pour la première fois en 1981, Gurny et al. [8] ont préparé des nanosphères de PLA par la technique d’émulsion/évaporation de solvant. Cette technique consiste à préparer une émulsion (simple ou double) puis à éliminer le solvant organique par évaporation. Lors de cette élimination, le polymère précipite, ce qui conduit à la formation de sphères. Dans un premier temps, le polymère choisi pour constituer les nanoparticules est dissous dans un solvant organique non miscible à l’eau (dichlorométhane, chloroforme, ou acétate d’éthyle) [9]. Ce mélange est ensuite émulsifié dans une phase aqueuse contenant un stabilisant (cholate de sodium, poly (alcool vinylique) (PVA)) [4, 10] par fort cisaillement ou par sonication pour former une émulsion H/E stable.
Le solvant organique est alors évaporé par élévation de la température ou sous pression réduite, ou simplement par agitation à température ambiante. Cette méthode permet l’encapsulation de principe actif hydrophobe par simple ajout 6 du composé dans la solution de polymère. Après évaporation du solvant organique, le médicament encapsulé se trouve au sein de la matrice polymère [11]. Dans le cas d’un principe actif hydrophile, celui-ci doit au préalable être dispersé sous forme de solution aqueuse dans la phase organique contenant le polymère. Cette émulsion est elle-même dispersée dans une phase aqueuse externe pour constituer une émulsion double E/H/E [10]. Après évaporation du solvant organique, il se forme des nanosphères contenant le principe actif hydrosoluble. Cette technique a été utilisée pour encapsuler de l’albumine de sérum bovin (BSA) [12] ou de l’érythropoïétine [13]. Pour cette technique, il est nécessaire d’employer des tensioactifs pour faciliter la formation et améliorer la stabilité des émulsions [11]. De plus, des énergies importantes sont indispensables pour former une émulsion homogène. Enfin, les nanoparticules doivent être purifiées pour éliminer le solvant résiduel, potentiellement toxique. Toutes ces raisons limitent l’application de cette technique à la production industrielle.
Sur la figure 1[8] nous montrons la méthode d’émulsification-évaporation de solvant pour l’obtention de nanosphères.

Fluide supercritique

Pour résoudre les problèmes posés par l’émulsion/évaporation de solvant, la technique, dite Rapid Expansion of Supercritical Solvent (RESS), a été développée. Elle consiste à dissoudre le polymère et le principe actif à encapsuler dans un fluide supercritique (FSC). Ensuite, une réduction rapide de pression due à l’expansion du FSC dans l’air provoque la saturation et la précipitation du soluté, ce qui permet d’obtenir des particules. Les produits finaux ont une bonne pureté [14]. Le FSC utilisé est souvent le CO2, puisqu’il est non toxique, non inflammable, relativement inerte et recyclable [15]. Cette technique est limitée par la faible solubilité des polymères et des principes actifs dans le FSC, et la taille de particules obtenue par cette méthode est souvent supérieure à 1 µm [16]. De plus, elle nécessite une très haute pression, généralement supérieure à 200 bars [15].
Parfois, l’utilisation d’une faible quantité de solvant organique (acétone, éthanol) [17] permet d’améliorer la solubilité du polymère dans le FSC, et d’optimiser les conditions d’opération. On peut alors normalement travailler à une pression inférieure à 100 bars lorsque la température est légèrement supérieure à la température critique du CO2 (304,1 K) [15]. Pour limiter la formation d’agrégats et obtenir des particules submicroniques, le RESS a été modifié par la mise en place d’une solution contenant un tensioactif après l’expansion rapide du FSC, dit Rapid Expansion of a super critical solution into a liquid SOLVent (RESOLV) [18]. En utilisant cette technique, Meziani et al.
[19] ont préparé des nanoparticules de PLA et de PMMA en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS) et de PVA comme tensioactif, et d’éthanol comme solvant.

« Salting out »

Le procédé de « salting out » consiste à ajouter, sous agitation, une solution aqueuse saturée en sel et contenant un stabilisant (par exemple : le PVA) à une solution acétonique de polymère. Dans ce cas, la miscibilité des deux phases est empêchée par la saturation en sel de la phase aqueuse, ce qui conduit à la formation d’une émulsion de type huile/eau. De l’eau pure est ensuite ajoutée au système, ce qui permet la diffusion complète de l’acétone dans la phase aqueuse. Ceci provoque la précipitation du polymère et la formation des particules. Cette technique permet l’encapsulation de principes actifs hydrophobes, solubles dans des solvants polaires [20]. La méthode d’émulsification/diffusion de solvant peut être considérée comme une modification du procédé de « salting out ». Dans ce cas, le solvant organique utilisé n’est que partiellement soluble dans l’eau. Le solvant, dans lequel est dissous le polymère, est initialement saturé en eau pour assurer l’équilibre thermodynamique des deux phases. Puis, il est émulsifié dans une phase aqueuse contenant un tensioactif.
L’addition d’eau, après avoir obtenu l’émulsion, provoque la diffusion du solvant dans la phase aqueuse et entraîne la précipitation du polymère.

Nanoprécipitation

Le processus de nanoprécipitation a été décrit pour la première fois par Fessi et al. [21] en 1986. Celui-ci requiert l’utilisation d’une phase organique polaire contenant le polymère et le principe actif organosoluble. Cette phase organique doit être un solvant miscible à l’eau tel que l’acétone. Cette solution de polymère est émulsifiée dans une phase aqueuse (le tensioactif est facultatif) pour former des gouttelettes. La diffusion spontanée du solvant dans la phase aqueuse entraine une précipitation du polymère, et la formation de nanoparticules solides. Ce procédé permet l’incorporation d’une grande quantité de médicament avec un excellent rendement. Ainsi, ni l’évaporation, ni l’extraction de solvant ne sont nécessaires à la précipitation du polymère. Cependant, ce mode de fabrication est limité aux principes actifs hydrophobes, qui sont solubles dans un solvant polaire mais insolubles dans l’eau, par exemple, l’isradipine (agent contre l’hypertension) [22].

Procédés d’hydrophilisation de surface.

Selon leur structure et leur mode d’adsorption, les polymères amphiphiles peuvent adopter des conformations très différentes à la surface des particules. Dans le cas d’un polymère uniquement substitué en extrémité de chaîne par un segment interagissant avec la particule, l’adsorption du polymère à la surface des particules, de type « end-on », s’effectue par un seul site. Le polymère adopte alors une conformation en brosse. Par contre, si le polymère est porteur de plusieurs motifs « réactifs » le long de la chaîne macromoléculaire, l’adsorption du polymère, de type « side-on », s’effectue par de nombreux sites de fixation. Le polymère adopte alors une conformation en boucle-trains et queues à la surface. « end-on » « side-on ». D’une manière générale, les procédés d’hydrophilisation les plus employés reposent soit sur l’adsorption physique de polymères amphiphiles lors de la préparation des nanoparticules, soit sur le greffage chimique de polymères hydrophiles à la surface de particules.

Adsorption physique de polymères amphiphiles

Une des méthodes couramment utilisées consiste à adsorber physiquement des polymères à l’interface solide-liquide. Cette adsorption physique est régie par des interactions électrostatiques ou hydrophobes. Dans le cas des particules chargées, des polyélectrolytes tels que le chitosane [23] et l’acide hyaluronique [24] s’adsorbent sur la surface de charge opposée par interaction électrostatique. Dans le cas de particules hydrophobes et neutres, la surface est souvent modifiée par des dérivés amphiphiles des polysaccharides [25 ; 26] ou du POE [27 ; 28]. Ces dérivés possédant des propriétés tensioactives, ils sont capables de s’adsorber sur une surface hydrophobe pour y former une couche hydrophile. Cette adsorption ne nécessite pas la présence d’extrémités ou de segments « réactifs » à la surface des nanoparticules. Cette technique présente une grande facilité de mise en œuvre puisqu’il s’agit simplement de mettre en contact des nanoparticules préformées à surface hydrophobe et/ou chargée, avec un polymère hydrosoluble en solution aqueuse. Cependant, ce type de recouvrement n’offre pas de garantie quant à la stabilité de la couche adsorbée, laquelle peut être déplacée par exemple par les protéines plasmatiques [29]. Dans le cas de la polymérisation en émulsion du monomère, l’hydrophilisation de la surface de particules est réalisée au cours de la polymérisation et de la formation de particules. Avant la polymérisation du monomère, le polymère amphiphile s’adsorbe à la surface des gouttes de monomère (interface liquide/liquide) ; après la réaction, le polymère amphiphile s’adsorbe à la surface des particules solides [30]. Le recouvrement de la couche hydrophile est également dû à une adsorption physique.

Fixation chimique du polymère hydrophile

L’hydrophilisation de surfaces par fixation chimique consiste à former des liaisons covalentes entre les chaînes hydrophiles et la surface à modifier.
Cette technique permet d’avoir une bonne stabilité de la couche hydrophile par rapport à celle obtenue par adsorption physique. Le greffage covalent de chaînes en surface peut être réalisé par couplage d’un polymère hydrophile préformé sur la surface de particules. Dans ce cas, la surface hydrophobe et les chaînes hydrophiles doivent être fonctionnalisées. Une autre méthode permettant que des chaînes hydrophiles soient fixées chimiquement au cœur de la particule, consiste à utiliser des copolymères amphiphiles organosolubles préformés, dans des méthodes d’émulsion/évaporation de solvant [31 ; 32] ou de nanoprécipitation [33]. Au cours du procédé d’élaboration des particules, les segments hydrophobes des copolymères sont dissous dans la phase organique alors que les segments hydrophiles s’exposent à la phase aqueuse. Après élimination du solvant organique, les particules possèdent un cœur riche en chaînes hydrophobes et une couronne constituée de chaînes hydrophiles. L’utilisation de tels copolymères amphiphiles permet un bon contrôle de la structure particulaire car leur composition peut être bien définie [34]. Des exemples de cette méthode ont été décrits en particulier avec des copolymères dibloc tels que le poly (méthoxy poly (oxyde d’éthylène) cyanoacrylate-co-hexadécyl cyanoacrylate) [31, 36] et le poly (lactide)-bpoly (oxyde d’éthylène) organosoluble [36], ou avec un tribloc comme le POE-PPO-POE [37].

Caractérisation

Les propriétés physicochimiques des nanoparticules sont en relation avec leur capacité d’encapsulation et de stockage du principe actif d’une part, mais interviennent aussi sur les interactions avec les membranes biologiques et les profils de libération. Ces propriétés sont principalement la distribution de taille, la nature et l’épaisseur de la membrane, la charge en surface, l’hydrophobie. La mesure du taux d’encapsulation ainsi que les études de libération du principe actif in vitro permettent aussi de caractériser les nanoparticules.

Distribution de taille et structure

La distribution de taille des nanoparticules est généralement mesurée par des techniques de granulométrie laser en milieu dilué, basées sur la diffusion quasi élastique de la lumière associée au mouvement Brownien des particules. En effet, les nanoparticules en suspension sont en mouvement constant et aléatoire fonction de leur faible taille.
Les fluctuations d’un faisceau laser traversant la suspension sont reliées à la taille des nanoparticules. Les granulomètres lasers spécifiques aux systèmes dispersés de taille submicronique permettent d’obtenir une mesure simple et rapide de la distribution de taille des particules.
La taille des particules peut également être déterminée par observation microscopique et analyse des images obtenues. La microscopie électronique (à balayage ou à transmission) est nécessaire pour atteindre la résolution suffisante à l’observation des nanoparticules. La microscopie électronique à balayage (MEB) permet d’obtenir des informations basiques sur la forme des particules et leurs caractéristiques de surface, la microscopie à force atomique (AFM) peut être utilisée pour accéder aux détails de la morphologie, elle conduit à des images en trois dimensions de la surface des particules. La microscopie électronique à transmission (MET) est plus utilisée pour déterminer la distribution de taille et la structure des particules, elle peut être associée à une étape de préalable de cryofracture. Il est ainsi possible de confirmer la structure vésiculaire ou matricielle des particules ainsi que d’estimer l’épaisseur de la membrane dans le cas des capsules (quelques nanomètres en général). La structure des nanoparticules peut également être déterminée par des mesures de densité en utilisant une technique de centrifugation sur gradient de densité qui permet de séparer les particules en fonction de leur densité. La densité des nanocapsules est en effet inférieure à celle des nanosphères qui contiennent plus de polymère et supérieure à celle des nanoémulsions qui n’en contiennent pas du tout.

Propriétés de surface

La propriété la plus évidente des systèmes dispersés de type nanoparticules est leur grande aire interfaciale inversement proportionnelle à leur taille. Cette surface a une charge qui influence la stabilité des systèmes d’une part et leurs interactions avec le milieu biologique d’autre part.
La caractérisation de surface des particules passe par la mesure du potentiel Zéta qui représente le potentiel de surface dû à la présence de charges provenant du polymère ou des tensioactifs adsorbés. Le potentiel Zéta peut être mesuré par l’intermédiaire de la mobilité électrophorétique des particules (déplacement dans un champ électrique), il permet de prédire la stabilité des nanoparticules en suspension et les interactions par attractions électrostatiques.
Il est généralement admis qu’une valeur élevée, supérieure à 30mV en valeur absolue, est nécessaire pour garantir la stabilité de la dispersion.
L’hydrophobie de surface peut être approchée par adsorption de fluorochrome hydrophobe ou par la mesure d’angle de contact. Des techniques de spectroscopie aux rayons X développées récemment permettent l’identification chimique des éléments présents en surface des particules. La modification de l’état de surface des nanoparticules est une technique envisagée afin d’augmenter les potentialités de ciblage de ces vecteurs. Il est en effet reconnu que la présence de groupes hydrophiles en surface permet de réduire la capture des particules par les macrophages et de prolonger ainsi le temps de résidence dans la circulation après administration intraveineuse : on parle alors de vecteurs furtifs. Généralement le polyéthylène glycol est utilisé comme groupe hydrophile, sa présence en surface peut être obtenue soit par adsorption de tensioactif sur les nanoparticules, soit en utilisant des copolymères à base de PEG pour la formation des particules. De nombreux travaux sont également développés pour coupler en surface des nanoparticules des éléments de reconnaissance (anticorps monoclonaux, sucres, peptides…) afin d’accroître leur capacité de vectorisation et donc leur spécificité d’action.

Capacité d’encapsulation

La capacité d’encapsulation dépend à la fois des propriétés du principe actif et du procédé utilisé. Elle est généralement supérieure pour les principes actifs lipophiles sauf si la production des particules se fait en phase externe organique. La mesure de l’efficacité d’encapsulation se fait après séparation des nanoparticules du milieu par ultrafiltration et/ou ultracentrifugation. La quantité de principe actif contenue dans les particules est alors dosée après dissolution, la quantité de principe actif non encapsulé dans la phase externe peut également être dosée. L’efficacité d’encapsulation est alors décrite comme le rapport entre la quantité de principe actif initialement introduite dans la formule et la quantité incorporée dans les nanoparticules. Elle dépend de la solubilité du principe actif dans le cœur huileux pour les nanocapsules, de son coefficient de partage entre les phases organique et aqueuse, de la concentration initiale et des interactions éventuelles polymère/principe actif. La capacité d’incorporation est bien sûr très supérieure pour les nanocapsules, le rapport principe actif/polymère est alors élevé (>1) alors qu’il est généralement inférieur à 0,5 pour les nanosphères.

Libération in vitro

La libération du principe actif in vitro dans différents milieux caractéristiques permet d’évaluer le comportement des nanoparticules après administration. Les études de libération sont confrontées à des difficultés liées à la faible taille des particules. La séparation du principe actif libéré dans la phase externe par rapport aux nanoparticules en est une. La méthode par dialyse permet d’éviter la séparation, les nanoparticules étant séparées du milieu récepteur par une membrane perméable au principe actif. Le couplage entre centrifugation et filtration permet également d’accéder à la quantité de principe actif libéré. Enfin il est également possible de mesurer in situ par spectrométrie le principe actif libéré et dissous dans la suspension, s’il possède des propriétés spectroscopiques différentes de celle du principe actif contenu dans les particules.
La libération du principe actif dépend essentiellement de sa solubilité dans le milieu externe, de son coefficient de partage entre les phases, du milieu et des volumes de dilution utilisés pour la mesure, mais aussi des propriétés des particules : taille, structure de la particule, nature et épaisseur de la membrane.
Le mécanisme de dégradation éventuelle ou de gonflement du polymère est également un élément influençant la libération.

Stabilité

La stabilité des nanoparticules sous-entend la stabilité physique de la dispersion, la stabilité chimique du système ainsi que la stabilité de l’encapsulation. La stabilité physique de la dispersion correspond à l’absence de sédimentation ou d’agglomération, elle peut être évaluée par des contrôles de distributions de taille qui doivent restées inchangées lors du stockage. La stabilité peut être améliorée en ajoutant un dispersant dans la préparation. Dans le cas des nanoparticules lipidiques solides, les lipides utilisés possèdent plusieurs formes cristallines vers lesquelles ils peuvent évoluer en modifiant l’encapsulation et la libération des actifs.
La stabilité chimique permet d’assurer la non dégradation du polymère ou des phospholipides. Elle peut être suivie par mesure de la variation éventuelle de la masse molaire du polymère ou par une modification du pH du milieu.
Il est également nécessaire de s’assurer de la permanence de l’encapsulation, en vérifiant que la charge des nanoparticules en principe actif n’évolue pas au cours du temps au stockage et qu’il n’y a pas de dégradation du principe actif encapsulé.
La stabilité physicochimique des nanoparticules à long terme peut être améliorée en ajoutant une étape de séchage des suspensions.
La lyophilisation est alors généralement utilisée, elle permet, moyennant l’utilisation d’agents cryoprotecteurs et le choix des conditions opératoires (en particulier lors de la congélation) de présenter les nanoparticules sous forme de poudre aisément redispérsible dans l’eau.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE
I METHODES DE PREPARATION DES NANOPARTICULES
I.1 Préparation de nanoparticules par polymérisation de monomères
I.2 Préparation de nanoparticules à partir de polymères préformés
I.2.1 Emulsion/évaporation de solvant
I.2.2 Fluide supercritique
I.2.3 « Salting out »
I.2.4 Nanoprécipitation
I.3 Procédés d’hydrophilisation de surface.
I.3.1 Adsorption physique de polymères amphiphiles
I.3.2 Fixation chimique du polymère hydrophile
I.4 Caractérisation
I.4.1 Distribution de taille et structure
I.4.2 Propriétés de surface
I.4.3 Capacité d’encapsulation
I.4.4 Libération in vitro
I.4.5 Stabilité
II GENERALITES SUR LES EMULSIONS DE PICKERING
II.1 . Formulation et caractérisations des émulsions de Pickering
II.1.1 . Formulation
II.1.2 Caractérisations
II.1.2.1 Détermination du sens de l’émulsion
II.1.2.2 Détermination de la granulométrie
II.1.2.3 Détermination de la viscosité
II.1.2.4 Détermination du pH
II.2 Stabilisation des émulsions de Pickering
II.2.1 Structure et mécanismes de stabilisation de l’interface
II.2.1.1 Structure de l’interface
II.2.1.2 Mécanismes de stabilisation
II.2.1.2.1 Mouillage des particules et positionnement à l’interface
II.2.1.2.2 Mesure de l’angle de contact
II.2.2 Aspect énergétique
II.2.3 Interaction entre particules à l’interface
II.3 Les phénomènes d’instabilité
II.3.1 Sédimentation et crémage
II.3.2 Floculation
II.3.3 Coalescence
II.3.4 Mûrissement d’Ostwald
II.3.5 Inversion de phase
III APPLICATIONS DES EMULSIONS DE PICKERING DANS L’INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE ET COSMETIQUE.
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
I OBJECTIF GENERAL :
II CADRE DE L’ETUDE
III SYNTHESE ET CARACTERISATION DES NANOPARTICULES
III.1 Réactifs
III.2 Matériel
III.3 Méthodes
III.3.1 Méthode de synthèse
III.3.2 Méthode de caractérisation
IV ETUDE DE FORMULATION
IV.1 Mesure de l’angle de contact
IV.1.1 Matériel
IV.1.2 Méthode
IV.2 Mesure de la tension superficielle
IV.2.1 Matériel
IV.2.2 Méthodes
V FORMULATION DES EMULSIONS DE PICKERING
V.1 Réactifs
V.2 Matériel
V.3 Méthode
V.3.1 Méthode de préparation
V.3.2 Méthode de caractérisation
VI RESULTATS
VI.1 Synthèse et caractérisation des nanoparticules
VI.2 Etude de formulation
VI.2.1 Mesure de l’angle de contact liquide-liquide (huile/eau)
VI.2.2 Mesure de la tension superficielle
.VI.3 Formulation des émulsions de Pickering
VI.3.1 Examen macroscopique
VI.3.2 Détermination du sens de l’émulsion (Examen microscopique)
VI.3.2.1 Le test aux colorants :
VI.3.2.2 Mesure de la conductivité
VI.3.3 Détermination de la taille des gouttelettes
VI.3.4 La mesure du pH
VII DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES

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