Préparation de nanoparticules par polymérisation de monomères

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Procédés d’hydrophilisation de surface

Selon leur structure et leur mode d’adsorption, les polymères amphiphiles peuvent adopter des conformations très différentes à la surface des particules. Dans le cas d’un polymère uniquement substitué en extrémité de chaîne par un segment interagissant avec la particule, l’adsorption du polymère à la surface des particules, de type « end-on », s’effectue par un seul site. Le polymère adopte alors une conformation en brosse. Par contre, si le polymère est porteur de plusieurs motifs « réactifs » le long de la chaîne macromoléculaire, l’adsorption du polymère, de type « side-on », s’effectue par de nombreux sites de fixation. Le polymère adopte alors une conformation en boucle-trains et queues à la surface. « end-on » « side-on ». D’une manière générale, les procédés d’hydrophilisation les plus employés reposent soit sur l’adsorption physique de polymères amphiphiles lors de la préparation des nanoparticules, soit sur le greffage chimique de polymères hydrophiles à la surface de particules.

Adsorption physique de polymères amphiphiles

Une des méthodes couramment utilisées consiste à adsorber physiquement des polymères à l’interface solide-liquide. Cette adsorption physique est régie par des interactions électrostatiques ou hydrophobes. Dans le cas des particules chargées, des polyélectrolytes tels que le chitosane [23] et l’acide hyaluronique [24] s’adsorbent sur la surface de charge opposée par interaction électrostatique. Dans le cas de particules hydrophobes et neutres, la surface est souvent modifiée par des dérivés amphiphiles des polysaccharides [25 ; 26] ou du POE [27 ; 28]. Ces dérivés possédant des propriétés tensioactives, ils sont capables de s’adsorber sur une surface hydrophobe pour y former une couche hydrophile. Cette adsorption ne nécessite pas la présence d’extrémités ou de segments « réactifs » à la surface des nanoparticules. Cette technique présente une grande facilité de mise en œuvre puisqu’il s’agit simplement de mettre en contact des nanoparticules préformées à la surface hydrophobe et/ou chargée, avec un polymère hydrosoluble en solution aqueuse. Cependant, ce type de recouvrement n’offre pas de garantie quant à la stabilité de la couche adsorbée, laquelle peut être déplacée par exemple par les protéines plasmatiques [29]. Dans le cas de la polymérisation en émulsion du monomère, l’hydrophilisation de la surface de particules est réalisée au cours de la polymérisation et de la formation de particules. Avant la polymérisation du monomère, le polymère amphiphile s’adsorbe à la surface des gouttes de monomère (interface liquide/liquide) ; après la réaction, le polymère amphiphile s’adsorbe à la surface des particules solides [30]. Le recouvrement de la couche hydrophile est également dû à une adsorption physique.

Fixation chimique du polymère hydrophile

L’hydrophilisation de surfaces par fixation chimique consiste à former des liaisons covalentes entre les chaînes hydrophiles et la surface à modifier. Cette technique permet d’avoir une bonne stabilité de la couche hydrophile par rapport à celle obtenue par adsorption physique. Le greffage covalent de chaînes en surface peut être réalisé par couplage d’un polymère hydrophile préformé sur la surface de particules. Dans ce cas, la surface hydrophobe et les chaînes hydrophiles doivent être fonctionnalisées. Une autre méthode permettant que des chaînes hydrophiles soient fixées chimiquement au cœur de la particule, consiste à utiliser des copolymères amphiphiles organosolubles préformés, dans des méthodes d’émulsion/évaporation de solvant [31 ; 32] ou de nanoprécipitation [33]. Au cours du procédé d’élaboration des particules, les segments hydrophobes des copolymères sont dissous dans la phase organique alors que les segments hydrophiles s’exposent à la phase aqueuse. Après élimination du solvant organique, les particules possèdent un cœur riche en chaînes hydrophobes et une couronne constituée de chaînes hydrophiles. L’utilisation de tels copolymères amphiphiles permet un bon contrôle de la structure particulaire car leur composition peut être bien définie [34]. Des exemples de cette méthode ont été décrits en particulier avec des copolymères dibloc tels que le poly (méthoxy poly (oxyde d’éthylène) cyanoacrylate-co-hexadécyl cyanoacrylate) [31 ; 36] et le poly(lactide)-bpoly (oxyde d’éthylène) organosoluble [37], ou avec un tribloc comme le POE-PPO-POE [36].

Caractérisation

Les propriétés physicochimiques des nanoparticules sont en relation avec leur capacité d’encapsulation et de stockage du principe actif d’une part, mais interviennent aussi sur les interactions avec les membranes biologiques et les profils de libération. Ces propriétés sont principalement la distribution de taille, la nature et l’épaisseur de la membrane, la charge en surface, l’hydrophobie. La mesure du taux d’encapsulation ainsi que les études de libération du principe actif in vitro permettent aussi de caractériser les nanoparticules.

Distribution de taille et structure

La distribution de taille des nanoparticules est généralement mesurée par des techniques de granulométrie laser en milieu dilué, basées sur la diffusion quasi élastique de la lumière associée au mouvement Brownien des particules. En effet, les nanoparticules en suspension sont en mouvement constant et aléatoire fonction de leur faible taille. Les fluctuations d’un faisceau laser traversant la suspension sont reliées à la taille des nanoparticules. Les granulomètres lasers spécifiques aux systèmes dispersés de taille submicronique permettent d’obtenir une mesure simple et rapide de la distribution de taille des particules.
La taille des particules peut également être déterminée par observation microscopique et analyse des images obtenues. La microscopie électronique (à balayage ou à transmission) est nécessaire pour atteindre la résolution suffisante à l’observation des nanoparticules. La microscopie électronique à balayage (MEB) permet d’obtenir des informations basiques sur la forme des particules et leurs caractéristiques de surface, la microscopie à force atomique (AFM) peut être utilisée pour accéder aux détails de la morphologie, elle conduit à des images en trois dimensions de la surface des particules. La microscopie électronique à transmission (MET) est plus utilisée pour déterminer la distribution de taille et la structure des particules, elle peut être associée à une étape de préalable de cryofracture. Il est ainsi possible de confirmer la structure vésiculaire ou matricielle des particules ainsi que d’estimer l’épaisseur de la membrane dans le cas des capsules (quelques nanomètres en général). La structure des nanoparticules peut également être déterminée par des mesures de densité en utilisant une technique de centrifugation sur gradient de densité qui permet de séparer les particules en fonction de leur densité. La densité 14
des nanocapsules est en effet inférieure à celle des nanosphères qui contiennent plus de polymère et supérieure à celle des nanoémulsions qui n’en contiennent pas du tout.

Propriétés de surface

La propriété la plus évidente des systèmes dispersés de type nanoparticules est leur grande aire interfaciale inversement proportionnelle à leur taille. Cette surface a une charge qui influence la stabilité des systèmes d’une part et leurs interactions avec le milieu biologique d’autre part.
La caractérisation de surface des particules passe par la mesure du potentiel Zéta qui représente le potentiel de surface dû à la présence de charges provenant du polymère ou des tensio actifs adsorbés. Le potentiel Zéta peut être mesuré par l’intermédiaire de la mobilité électrophorétique des particules (déplacement dans un champ électrique), il permet de prédire la stabilité des nanoparticules en suspension et les interactions par attractions électrostatiques.
Il est généralement admis qu’une valeur élevée, supérieure à 30mV en valeur absolue, est nécessaire pour garantir la stabilité de la dispersion.
L’hydrophobie de surface peut être approchée par adsorption de fluorochrome hydrophobe ou par la mesure d’angle de contact. Des techniques de spectroscopie aux rayons X développées récemment permettent l’identification chimique des éléments présents en surface des particules. La modification de l’état de surface des nanoparticules est une technique envisagée afin d’augmenter les potentialités de ciblage de ces vecteurs. Il est en effet reconnu que la présence de groupes hydrophiles en surface permet de réduire la capture des particules par les macrophages et de prolonger ainsi le temps de résidence dans la circulation après administration intraveineuse : on parle alors de vecteurs furtifs. Généralement le polyéthylène glycol est utilisé comme groupe hydrophile, sa présence en surface peut être obtenue soit par adsorption de tensio actif sur les 15 nanoparticules, soit en utilisant des copolymères à base de PEG pour la formation des particules. De nombreux travaux sont également développés pour coupler en surface des nanoparticules des éléments de reconnaissance (anticorps monoclonaux, sucres, peptides…) afin d’accroître leur capacité de vectorisation et donc leur spécificité d’action.

Capacité d’encapsulation

La capacité d’encapsulation dépend à la fois des propriétés du principe actif et du procédé utilisé. Elle est généralement supérieure pour les principes actifs lipophiles sauf si la production des particules se fait en phase externe organique.
La mesure de l’efficacité d’encapsulation se fait après séparation des nanoparticules du milieu par ultrafiltration et/ou ultracentrifugation. La quantité de principe actif contenue dans les particules est alors dosée après dissolution, la quantité de principe actif non encapsulé dans la phase externe peut également être dosée. L’efficacité d’encapsulation est alors décrite comme le rapport entre la quantité de principe actif initialement introduite dans la formule et la quantité incorporée dans les nanoparticules. Elle dépend de la solubilité du principe actif dans le cœur huileux pour les nanocapsules, de son coefficient de partage entre les phases organique et aqueuse, de la concentration initiale et des interactions éventuelles polymère/principe actif. La capacité d’incorporation est bien sûr très supérieure pour les nanocapsules, le rapport principe actif/polymère est alors élevé (>1) alors qu’il est généralement inférieur à 0,5 pour les nanosphères.

Libération in vitro

La libération du principe actif in vitro dans différents milieux caractéristiques permet d’évaluer le comportement des nanoparticules après administration. Les études de libération sont confrontées à des difficultés liées à la faible taille des particules. La séparation du principe actif libéré dans la phase externe par rapport aux nanoparticules en est une. La méthode par dialyse permet d’éviter la séparation, les 16 nanoparticules étant séparées du milieu récepteur par une membrane perméable au principe actif. Le couplage entre centrifugation et filtration permet également d’accéder à la quantité de principe actif libéré. Enfin il est également possible de mesurer in situ par spectrométrie le principe actif libéré et dissous dans la suspension, s’il possède des propriétés spectroscopiques différentes de celle du principe actif contenu dans les particules.
La libération du principe actif dépend essentiellement de sa solubilité dans le milieu externe, de son coefficient de partage entre les phases, du milieu et des volumes de dilution utilisés pour la mesure, mais aussi des propriétés des particules : taille, structure de la particule, nature et épaisseur de la membrane. Le mécanisme de dégradation éventuelle ou de gonflement du polymère est également un élément influençant la libération.

Stabilité

La stabilité des nanoparticules sous-entend la stabilité physique de la dispersion, la stabilité chimique du système ainsi que la stabilité de l’encapsulation. La stabilité physique de la dispersion correspond à l’absence de sédimentation ou d’agglomération, elle peut être évaluée par des contrôles de distributions de taille qui doivent restées inchangées lors du stockage. La stabilité peut être améliorée en ajoutant un dispersant dans la préparation. Dans le cas des nanoparticules lipidiques solides, les lipides utilisés possèdent plusieurs formes cristallines vers lesquelles ils peuvent évoluer en modifiant l’encapsulation et la libération des actifs.
La stabilité chimique permet d’assurer la non dégradation du polymère ou des phospholipides. Elle peut être suivie par mesure de la variation éventuelle de la masse molaire du polymère ou par une modification du pH du milieu.
Il est également nécessaire de s’assurer de la permanence de l’encapsulation, en vérifiant que la charge des nanoparticules en principe actif n’évolue pas au cours du temps au stockage et qu’il n’y a pas de dégradation du principe actif encapsulé.
La stabilité physicochimique des nanoparticules à long terme peut être améliorée en ajoutant une étape de séchage des suspensions. La lyophilisation est alors généralement utilisée, elle permet, moyennant l’utilisation d’agents cryoprotecteurs et le choix des conditions opératoires (en particulier lors de la congélation) de présenter les nanoparticules sous forme de poudre aisément redispersible dans l’eau.

Généralités sur les émulsions de Pickering

Formulation et caractérisations des émulsions de Pickering

Formulation

Une goutte peut se fractionner en plusieurs gouttelettes de taille inferieure sous l’action de forces mécaniques : pression, gradient de vitesse, ou forces turbulentes. Mais globalement, le fractionnement résulte des effets compétitifs entre les propriétés rhéologiques et interfaciales des deux phases, et des caractéristiques hydrodynamiques de l’écoulement via des forces mécaniques [38]. Avant la rupture d’une goutte, l’interface séparant la phase continue de la phase dispersée se déforme sous l’action des forces tangentielles et normales. La tension superficielle σ permet à une goutte sphérique de diamètre D de supporter une contrainte de même intensité que la différence de pression de part et d’autre de l’interface, appelée loi de Laplace [39].
Il existe une variété de techniques permettant la formation d’émulsions. Les plus utilisées sont : L’ultrasonication
Le principe repose sur l’irradiation d’un milieu liquide par des ondes sonores inférieures à 20 kHz (figure 4b).
L’agitation mécanique
Le principe repose sur le fractionnement d’une goutte en plusieurs gouttelettes de taille inferieure sous l’action d’une force mécanique (figure 4a).
– (a) : ultrasonication : (b) agitation mécanique,
Deux mécanismes permettent d’expliquer l’effet des ultrasons sur l’émulsification :
L’onde génère des instabilités à l’interface liquide-liquide, qui vont induire la formation de gouttelettes ;
L’implosion des bulles de cavitation près des gouttes de liquide va casser ces gouttes et on observe une réduction progressive du diamètre moyen de l’émulsion [40].
Ces techniques ont des avantages non négligeables : facilité de mise en œuvre, possibilité de préparer rapidement d’importants volumes d’émulsion. Cependant, les émulsions résultantes sont généralement polydispersées, ce qui rend difficiles les études systématiques et la rationalisation de tels systèmes [41]. Elles permettent également de créer de grandes quantités d’interface, afin de disperser une phase dans une autre pour former une émulsion. Il est alors possible de disperser une phase apolaire dans une phase polaire, conduisant à une émulsion huile dans eau ou au contraire de disperser une phase polaire dans une phase apolaire conduisant à une émulsion eau dans huile [42]. Plusieurs types de particules peuvent être utilisés pour la stabilisation des émulsions de Pickering : oxyde de fer, hydroxydes métalliques, silice, argiles, carbone [43 ; 44]. Les particules stabilisantes ne sont pas obligatoirement solides. Une stabilisation efficace a été observée avec des particules de microgels [45] des cristaux liquides, mais aussi avec des particules naturelles telles que des bactéries et des spores [46 ; 47].

Caractérisations

Détermination du sens de l’émulsion

La nature de la phase externe, et par conséquent le type d’émulsion, peuvent être détectés par différentes techniques :
Par des expériences de dispersibilité d’un petit volume d’émulsion dans une phase aqueuse ou huileuse : par exemple, si l’échantillon prélevé est dispersible dans l’eau (respectivement dans l’huile) l’émulsion est de type H/E (respectivement E/H) [48].
Par des mesures de conductivité :
En effet dans la majorité des cas, l’eau, contrairement à l’huile, contient des électrolytes. La conductivité de la phase aqueuse est donc 100 à 1000 fois plus élevée que celle de l’huile. La valeur de la conductivité d’une émulsion dépendant de sa phase externe, il est donc relativement facile de déterminer si l’émulsion est de type E/H ou de type H/E.
La conductivité d’une émulsion (χem) est directement liée à la conductivité de la phase externe (χext) et à sa fraction volumique (fW). Ainsi, en première approximation on peut utiliser la relation linéaire suivante : χem=fw. χext
La phase externe peut aussi être d’une importance capitale dans l’interprétation des phénomènes observés pour les émulsions, notamment pour détecter l’inversion de phase au cours d’un procédé d’émulsification [49].
Par les tests aux colorants :
Le principe de ces techniques repose sur la détermination de l’hydrosolubilité ou de la liposolubilité de l’émulsion formée via des colorants comme le bleu de méthylène et le rouge soudan.

Détermination de la granulométrie

Une des propriétés importantes des émulsions est la taille des gouttelettes, qui peut être déterminée par une méthode de mesure appelée « granulométrie ». La taille des gouttelettes est particulièrement représentative des conditions d’agitation et de formulation dans lesquelles l’émulsion a été élaborée. Dans la plupart des cas, une émulsion contient des gouttelettes de tailles différentes, notamment à cause du caractère partiellement ou totalement aléatoire des procédés d’agitation, donc une distribution de tailles de gouttelettes qui représente un inventaire statistique de la population présente dans l’émulsion. L’émulsion peut être caractérisée par une seule valeur de diamètre représentative d’une moyenne de l’ensemble de la population de gouttes [39].

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE
I METHODES DE PREPARATION DES NANOPARTICULES
I.1 Préparation de nanoparticules par polymérisation de monomères
I.2 Préparation de nanoparticules à partir de polymères préformés
I.2.1 Emulsion/évaporation de solvant
I.2.2 Fluide supercritique
I.2.3 « Salting out »
I.2.4 Nanoprécipitation
I.3 Procédés d’hydrophilisation de surface
I.3.1 Adsorption physique de polymères amphiphiles
I.3.2 Fixation chimique du polymère hydrophile
I.4 Caractérisation
I.4.1 Distribution de taille et structure
I.4.2 Propriétés de surface
I.4.3 Capacité d’encapsulation
I.4.4 Libération in vitro
I.4.5 Stabilité
II GENERALITES SUR LES EMULSIONS DE PICKERING
II.1 Formulation et caractérisations des émulsions de Pickering
II.1.1 Formulation
II.1.2 Caractérisations
II.1.2.1 Détermination du sens de l’émulsion
II.1.2.2 Détermination de la granulométrie
II.1.2.3 Détermination de la viscosité
II.1.2.4 Détermination du pH
II.2 Stabilisation des émulsions de Pickering
II.2.1 Structure et mécanismes de stabilisation de l’interface
II.2.1.1 Structure de l’interface
II.2.1.2 Mécanismes de stabilisation
II.2.2 Mouillage des particules et positionnement à l’interface
II.2.3 Mesure de l’angle de contact
II.2.4 Aspect énergétique
II.2.5 Interaction entre particules à l’interface
II.3 Les phénomènes d’instabilité
II.3.1 Sédimentation et crémage
II.3.2 Floculation
II.3.3 Coalescence
II.3.4 Mûrissement d’Ostwald
II.3.5 Inversion de phase
III APPLICATIONS DES EMULSIONS DE PICKERING DANS L’INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE ET COSMETIQUE.
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
I SYNTHESE ET CARACTERISATION DES NANOPARTICULES
I.1 Réactifs
I.2 Matériel
I.3 Méthodes
I.3.1 Méthode de synthèse
I.3.2 Caractérisation
II ETUDE DE FORMULATION
II.1 Mesure de l’angle de contact
II.1.1 Matériel
II.1.2 Méthode
II.2 Mesure de la tension superficielle
II.2.1 Matériel
II.2.2 Méthodes
III FORMULATION DES EMULSIONS DE PICKERING
III.1 Réactifs
III.2 Matériel
III.3 Méthode
IV RESULTATS
IV.1 Synthèse et caractérisation des nanoparticules
IV.2 Etude de formulation
IV.2.1 Mesure de l’angle de contact liquide liquide (huile/eau)
IV.2.2 Mesure de la tension superficielle
IV.3 Formulation des émulsions de Pickering
IV.3.1 Examen macroscopique
IV.3.2 Détermination du sens de l’émulsion
IV.3.2.1 Sens des émulsions (Examen microscopique)
IV.3.2.2 Le test aux colorants :
IV.3.3 Mesure de la conductivité
IV.3.4 Détermination de la taille des gouttelettes
IV.3.5 La mesure du pH
V DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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