Préparation de l’animal et dispositif expérimental pour le test de bronchospasme

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SEPARATION DE LA FRACTION ACTIVE D’E.B/FTM PAR CHROMATOGRAPHIE :

Recherche du solvant de migration :

La première étape d’une chromatographie sur colonne est la recherche de solvant de migration. Ainsi, des chromatographies sur couche mince ont été réalisées avec la fraction étudiée en utilisant de divers éluants et le gel de silice 60 F254(Merck) sur feuille plastique comme phase stationnaire. Les éluants utilisés ont été les suivants :
-Acétate d’éthyle/Méthanol/Eau (65/45/10)
-Butanol /Acide acétique/Eau (4/1/5)
-Dichlorométhane/Méthanol (80 /20)
Le solvant utilisé pour la chromatographie sur colonne sera celui qui sépare mieux le composé étudié.
Après la migration et la comparaison des différents chromatogrammes, le mélange Dichlorométhane/Méthanol (80 /20) a été choisi pour la chromatographie sur colonne.

Processus de la séparation :

La phase stationnaire utilisée est le Silicagel 60(Merck) de granulométrie 63 à 200 µm à raison de 50 g par gramme de la fraction à chromatographier.
D’après le résultat du test de relaxation de ces quatre fractions, la Fraction F.Met qui est la fraction active, a fait l’objet de processus de séparation par chromatographie sur une colonne de dimension 1,5cm x1, 5m. Cinq grammes de F.Met ont été chromatographiés sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant de migration le mélange DCM /MeOH. L’élution a été effectuée selon un gradient de polarité, en faisant varier les proportions de solvant constituant de l’éluant de 80/20 à 0/100(v/v). Les différentes fractions recueillies dans des tubes à essais ont été analysées sur CCM avec comme système des solvants de migration le DCM /MéOH (80/20). Les fractions qui présentent le même profil chromatographique ont été rassemblées puis évaporées sous vide à 40°C (Figure 4).

SCREENING PHYTOCHIMIQUE DE LA FRACTION ACTIVE

En fonction des résultats des tests d’activité pharmacologique, la fraction F.Met6 a été sélectionnée pour l’étude phytochimique.
Des chromatographies sur couche mince ont été effectuées sur cette fraction pour identifier ses constituants (MAROUF A. ; 2002). Pour cela, la fraction a été chromatographiée sur gel de silice 60 F254(MERCK) sur feuille plastique et éluée par un mélange des solvants DCM/MéOH (80/20). Après migration, la plaque a été séchée à la température ambiante pendant quelques minutes. La plaque a été ensuite vaporisée de révélateur caractéristique de chaque famille chimique à identifier (Tableau I) puis examinée sous UV (DAVE O. ; 2003).
La présence de famille chimique a été caractérisée par l’apparition de fluorescence ou de coloration intense de taches.
Les signes + et – ont été utilisés pour évaluer respectivement la présence ou l’absence d’une famille chimique.
Les réactifs utilisés pour le screening phytochimique sont représentés sur le Tableau I ci-après.

ETUDE PHARMACOLOGIQUE :

TEST IN VIVO :

Ce test avait pour objectif de mettre en évidence l’activité des extraits E.B/FTM sur le bronchospasme provoqué à l’histamine exogène chez les cobayes (PERRY et BOYD, 1941 ; LABARRE et PLISNIER ,1959).

Préparation de l’extrait :

L’Extrait Brut E.B /FTM a été dissout dans un mélange éthanol-eau (5/95).

Administration de l’extrait :

Quatre lots de 4 cobayes ont été utilisés .Le premier lot n’a reçu que de l’éthanol 5%, les trois autres lots ont été traités avec 5 , 10 et 15mg/kg d’ E.B/FTM . Ce traitement a été répété pendant trois jours par voie orale et le test de bronchospasme a été effectué 2h après la dernière administration (RAOELISON G.E. ,1998). Le volume administré a été de 1ml/Kg/jour.

Préparation de l’animal et dispositif expérimental pour le test de bronchospasme :

Le cobaye a été anesthésié avec de la Kétamine® à raison de 80mg/kg par voie intramusculaire. Après 15 à 30 minutes, l’animal a été fixé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température à 37°C. Une incision musculaire qui suit celle réalisée au niveau cutanée a été effectuée au niveau du cou de l’animal afin de dégager la trachée. Cette dernière a été cathéterisée. La canule trachéale est reliée d’une part à une pompe de starling pour assurer la respiration avec fréquence et débit constants et d’autre part à un transducteur qui est en relation avec l’enregistreur de réponse biologique. Puis la veine jugulaire a été canulée pour l’administration des produits.
Le Pancuronium®, un curarisant, à la concentration de 2mg/ml, à raison de 0,005ml/100g de poids corporel de l’animal a été administré par voie intraveineuse pour bloquer la respiration spontanée de cobaye (BRUGUEROLLE et coll., 1977).

Technique d’enregistrement :

Après 15 minutes d’adaptation de l’animal dans les conditions expérimentales, l’Histamine à 10µg /kg a été injecté au niveau de la veine jugulaire suivie de sérum physiologique.
Le volume d’air envoyé par la pompe excède les besoins respiratoires normaux du cobaye, cet excès d’air a été enregistré (PERRY et BOYD, 1941 ; LABARRE et PLISNIER ,1959).
L’activité d’E.B/FTM sur le bronchospasme a été exprimée en pourcentage d’inhibition par rapport au spasme provoqué à l’Histamine seule chez le lot témoin.
Le paramètre mesuré est la DI50 qui est la dose inhibant de 50% l’effet de l’histamine.

Préparation de l’organe :

Après avoir anesthésié le cobaye par la Kétamine® à raison de 80mg /kg, sa trachée a été rapidement isolée et placée dans la solution de KREBS-HEINSLEIT.

La trachée a été ensuite délicatement nettoyée et débitée transversalement en anneaux d’environ 3mm de longueur.

Dispositif expérimental :

Le dispositif expérimental est composé d’une cuve à organe isolé de capacité de 20 ml maintenue à 37°C et aéré avec du carbogène (95% O2, 5%CO2). Chaque cuve est relié à un capteur de tension (BUXCO) qui est connecté à un amplificateur-enregistreur graphique (BUXCO).

Technique d’enregistrement :

Les anneaux ont été montés dans des cuves à organe isolé de 20ml remplies de solution physiologique de KREBS et ont été soumis à une tension isométrique de 1,5g puis laissé se stabiliser pendant 90 minutes, période pendant laquelle l’organe a été rincé toutes les 30min c’est-à-dire que la solution de survie dans la cuve a été renouvelé 2 fois pendant cette période. Après cette phase d’équilibration, la préparation a été sensibilisée avec de l’Histamine à 10-4M, puis rincée trois fois et laissée au repos pendant 30minutes pour le retour à la tension de base.

Effet d’E.B/FTM sur la trachée isolée de cobaye précontractée avec l’Histamine:

L’objectif de ce test est d’évaluer l’activité relaxante d’E.B/FTM sur la trachée précontractée par l’Histamine (SATAKE et coll., 1998 ; KO et coll., 2002).

Après l’équilibration et sensibilisation suivies de rinçage et de repos, l’organe a été précontracté par

l’Histamine à 2×10-5M et au plateau de contraction, E.B/FTM à des concentrations croissantes et

cumulatives allant de 50 à 2500 µg/ml a été testé.

La relaxation induite par E.B/FTM est exprimée en pourcentage par rapport à la contraction

provoquée à l’Histamine.

Effet d’E.B/FTM vis-à-vis de l’activité contractile de l’Histamine sur la trachée isolée de cobaye:

L’objectif de ce test est de déterminer l’activité antihistaminique d’E.B/FTM (TSUKIYAMA et coll., 2007).

Après la phase d’équilibration, la sensibilisation suivie du rinçage et les 30 minutes de repos de l’organe, l’Histamine à des concentrations croissantes et cumulatives allant de 10-7M à 10-3M a été injecté et les réponses ont été enregistrées. L’organe a été rincé et laissé au repos pendant 30 minutes. Des concentrations d’E.B/FTM : 500 µg/ml ; 750 µg/ml ou 1000µg/ml ont été incubées dans la cuve pendant 30 minutes puis la même expérience avec l’Histamine a été répétée.

L’amplitude de contraction provoquée par l’Histamine en absence et en présence d’E.B/FTM a été mesurée.

Activité des différentes fractions d’E.B/FTM sur la trachée isolée de cobaye :

Les différentes fractions F.Hex, F.DCM, F.AE ou F.Met ont été dissoutes dans le mélange DMSO / Eau (10 /90).

Les mêmes protocoles que précédemment ont été effectués pour déterminer la fraction active d’E.B/FTM. Après avoir précontractée la trachée avec de l’Histamine à 2×10-5M et quand le plateau de contraction est atteint, des concentrations croissantes et cumulatives des différentes fractions : F.Hex, F.DCM, F.AE ou F.Met allant de 50 à 2000µg/ml ont été testées.

La fraction qui présente un pourcentage de relaxation le plus élevé c’est-à-dire ayant une valeur de CE50 la plus faible est considérée comme la plus active.

Recherche de la fraction active de F.Met :

Les fractions FMet1 à FMet7 ont été dissoutes dans le mélange DMSO/ Eau (10 /90).

Pour identifier la fraction active, les différentes fractions obtenues à partir de F.Met ont été testées à des concentrations allant de 5 à 200µg/ml en utilisant le même protocole que précédemment c’est-à-dire mesurer l’effet relaxant sur la trachée isolée de cobaye précontractée avec l’Histamine

à 2×10-5M.

Analyse de l’effet de F.Met6 :

Effet de Propranolol sur l’activité de F.Met6

Le Propranolol, un antagoniste β adrénergique, a été utilisé pour déterminer si l’activité F.Met6 est liée à l’activation de ces récepteurs β (JACQUES V., 1999). Des tests en absence ou en présence de Propranolol à 10-6M ont été effectués sur la trachée isolée de cobaye précontractée à l’histamine (RAMANITRAHASIMBOLA D.et coll., 2005).

Après l’équilibration, la sensibilisation suivi de rinçage, l’organe a été laissé au repos pendant 30 minutes puis précontracté à l’Histamine à 2×10-5M. Au plateau de contraction, des concentrations croissantes et cumulatives de F.Met6 allant de 5 à 200 µg/ml ont été testées. L’organe a été rincé de nouveau puis laissé au repos pendant 30 minutes.

Le Propranolol à 10-6M a été incubé dans la cuve pendant 30 minutes, puis la trachée a été précontractée avec la même concentration d’Histamine et les mêmes concentrations de F.Met6 ont été testées au plateau de contraction.

Les valeurs de CE50 de F.Met6 en absence ou en présence de Propranolol ont été comparées.

Effets combinés de F.Met6 et de la Théophylline :

Plusieurs molécules pourraient être associées afin d’obtenir ou non une synergie d’actions. Dans cette étude, l’effet combiné de F.Met6 et de la Théophylline a été étudié (RAMANITRAHASIMBOLA D.et coll., 2005). Les expériences réalisées sont les suivantes.

L’activité relaxante de F.Met6 à 50µg /ml ou de la Théophylline à 10-5M a été déterminée sur la trachée isolée de cobaye précontractée avec l’Histamine à 2×10-5M. L’organe a été rincé puis laissé au repos pendant 30 minutes. Au plateau de contraction provoqué à l’Histamine à 2×10-5M, F.Met6 à 50µg /ml et la Théophylline à 10-5M ont été testés.

La comparaison de l’effet relaxant expérimental des deux produits testés et la valeur théorique de la somme de leurs effets relaxants a permis de déduire la nature de l’effet combiné des deux produits.

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Table des matières

INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
A. Matériel végétal
B. Animaux d’expérience
C. Etude chimique
1. Extraction de FTM
2. Fractionnement d’E.B/FTM
3. Séparation chromatographique de la fraction active d’E.B/FTM
4. Screening phytochimique
D. Etude pharmacologique
1. Test pharmacologique in vivo d’E.B /FTM
1.1) Préparation de l’extrait à tester
1.2) Administration de l’extrait
1.3) Préparation de l’animal et dispositif expérimental pour le test de bronchospasme
1.4) Technique d’enregistrement
2. Test pharmacologique in vitro d’E.B/FTM
2.1) Préparation de l’extrait à tester
2.2) Préparation de la solution de survie
2.3) Préparation de l’organe
2.4) Dispositif expérimental
2.5) Technique d’enregistrement
2.6) Activité d’E.B/FTM sur la trachée isolée de cobaye précontractée à l’Histamine
2.7) Effet d’E.B/FTM vis-à-vis de l’activité contractile de l’Histamine
2.8) Recherche de la fraction active d’E.B/FTM
2.9) Recherche de la fraction active de F.Met
I ?2.10) Analyse de l’effet de F.Met.
a) Effet du Propranolol sur l’activité de F.Met6
b) Effet combiné avec la Théophylline
3. Produits utilisés
4. Analyse statistique et expression des données
E. Test de toxicité aigue
RESULTATS
I. RESULTATS CHIMIQUES
I.1 Rendement d’extraction de FTM
I.2 Rendements des différents fractionnements d’E.B/FTM
I.3 Rendements de la séparation chromatographique de F.Met
I.4 Constituants chimiques de la fraction F.Met6
II. RESULTATS PHARMACOLOGIQUES
II.1 Effet spasmolytique de l’extrait brut E.B/FTM
II.2 Activité bronchorelaxante d’E.B/FTM
II.3 Effet inhibiteur d’E.B/FTM sur l’activité de l’Histamine
II.4 Effet relaxant des différentes fractions d’E.B/FTM
II.5 Activité relaxante des différentes fractions de F.Met
II.6 Interaction entre F.Met6 et récepteurs ß2adrénergiques
II.7 Effets combinés de F.Met6 et de la Théophylline
III. TOXICITE D’E.B/FTM
DISCUSSION
CONCLUSION
ANNEXE
Références bibliographiques