Prédiction de la structure des complexes protéine-protéine

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Evaluation du modèle Ach-7/-cobratoxine

L’-cobratoxine est une neurotoxine, présente dans le venin des serpents. C’est un antagoniste du récepteur nicotinique à l’acétylcholine (AchR). L’AChBP est une protéine fonctionnellement et structuralement proche du domaine N-terminal de la sous unité de l’AChR et sa structure tridimensionnelle est connue (D’Adamo, Liu et al. 1998 ; Kashuba, Kvasha et al. 2001). La structure de l’-cobratoxine est également connue. Un modèle de Ach-7 a été obtenu par modélisation par homologie à partir de la structure cristalline de l’AchBP (PdB code : 1I9B) en utilisant Modeller (Sali, Potterton et al. 1995). Le pourcentage d’identité de séquence entre AchBP et la région extracellulaire de Ach-7 est de 24%. La structure cristalline -cobratoxin est disponible sur la PDB (PdB code : 2CTX). Dix contraintes ambigües dérivées de l’analyse des cycles de doubles mutants ont été utilisées : R33- P192, R33-F185, R33- E191, R33-K143, F65-S184, F65-E191, K35-E160, K35-S184, R36-P194, F29-W53. La plupart de ces contraintes concernent la boucle centrale de l’-cobratoxine, dont deux impliquent la région C-terminale. La flexibilité a été introduite à deux niveaux.
• D’une part, différentes conformations de la boucle F du récepteur (résidus 151- 170) ont été générées par dynamique moléculaire afin de sélectionner des conformations qui permettent l’accessibilité au site de liaison de la toxine.
• D’autre part durant la deuxième étape de la procédure d’amarrage, seuls les squelettes peptidiques sont maintenus dans leurs positions d’origine alors que les chaînes latérales sont libres. Après un dynamique de corps rigide avec des rayons de van der Waals réduit, dix structures sont sélectionnées et raffinées en libérant les chaînes latérales.
Toutes les structures de complexe obtenues sont similaires. Après superposition des récepteurs, l’écart entre les différentes positions de la toxine est de 0.65Å (FruchartGaillard, Gilquin et al. 2002). La meilleure structure, en termes d’énergie d’interaction de van der Waals, a été sélectionnée et renumérotée pour être comparée (Figure 23A,B) à la structure cristallographique du complexe AChBP/-cobratoxin (Bourne, Talley et al. 2005).
AChBP et α-cobratoxine sont respectivement en vert et bleue. Pour le model nAChR-a7 et α- cobratoxin sont respectivement en violet et rouge. (C) Zoom sur le site de liaison
La superposition des éléments de structure secondaire des deux complexes donne un écart de 2.3 Å de rmsd entre le modèle et la structure cristallographique. La Figure 23 montre que les deux structures se superposent, indiquant que la position et l’orientation de la toxine a été correctement prédite. Lorsque les deux récepteurs sont superposés, l’écart entre les C des toxines (L-rms) est égal à 4.4 Å. Les déviations majeures sont localisées dans les extrémités des boucles de la toxine et dans la boucle C du récepteur, une région peu conservée entre AChR-7 et AChBP (Figure 23C). Une flexibilité importante de cette région est observée dans plusieurs structures de complexe de ligand avec AChBP (Celie, Kasheverov et al. 2005; Hansen, Sulzenbacher et al. 2005). Par contre, la boucle F du récepteur du modèle se superpose bien avec celle de la structure cristallographique, indiquant l’efficacité de la procédure de dynamique moléculaire appliquée en amont de la procédure d’amarrage.
L’interface est similaire dans le modèle et dans la structure cristalline. L’écart entre les résidus de l’interface (I_rms) est égal à 3.6 Å. Le pourcentage de contacts natifs retrouvés dans le modèle est égal à 44%. Les valeurs individuelles de Fnat pour les résidus du « hot spot » R33, F65, K25 et R36 sont respectivement de 63%, 33 %, 100 % et 75%. Ces valeurs de Fnat sont satisfaisantes puisque le seuil généralement appliqué dans CAPRI pour admettre un accord avec la structure cristalline est de 30%.
Dans le modèle, comme dans la structure cristalline, les extrémités des boucles et le C-terminal de la toxine sont en contact avec le récepteur (résidus 7-9, 25-37, 49-52 et 65-69 dans le modèle et 6-9, 25-37, 51, 65-68 dans la structure cristalline). Il est à noter que bien qu’aucune contrainte impliquant la boucle I n’a été introduite, le même segment de cette boucle est en contact avec le récepteur AChBP ou AChR-7. Dans le modèle comme dans la structure cristallographique, la toxine se lie à l’interface entre deux sous unités (Figure 23A,B). Les mêmes régions du récepteur sont en contact avec le ligand c’est-à-dire la boucle A (résidus 91 dans le modèle et la structure cristallographique), la boucle B (résidus 143, 146, 147 et 152 dans le modèle et 147-148 structure cristallographique) et la boucle C (résidus 183-193 et 195 dans le modèle et résidus 183-193 dans structure cristallographique) pour la sous-unité 1, et en contact avec la boucle I (résidus 30, 32-36 dans le modèle et résidu 34 dans la structure cristallographique), boucle D (résidus 53-55 dans le modèle et résidus 53, 55 et 57 dans la structure cristallographique), boucle E (résidus 117 dans le modèle et résidus 107, 115 et 117 dans la structure cristallographique) et boucle F (résidus 159, 162, 165-169, 174 et 177 dans le modèle et résidus 161-163 et 166 dans la structure cristallographique) pour la seconde sous unité. Cette analyse révèle que cette approche a bien mis en évidence les contacts les plus importants pour la liaison de la toxine au récepteur.

Evaluation du modèle uPAR/uPA.GFD

uPA est l’activateur du plasminogène de type urokinase. uPAr son récepteur joue un rôle important dans la malignité des cancers humains. La structure du complexe uPAR lié à un peptide antagoniste a été déterminée au laboratoire (Llinas, Le Du et al. 2005). La structure d’uPA déterminée par RMN est disponible.
Le récepteur uPAR est composé de trois domaines à trois doigts qui forment une cavité dans laquelle est logé le peptide. Trois résidus hydrophobes de ce peptide (Phe5, Leu9 and Trp10) forment un motif qui se retrouve dans uPA (Ile28, Phe25 et Tyr24) bien que la structure secondaire des deux ligands soit différente. Vingt contraintes de distance ambigües entre uPAR and uPA ont été dérivées de cette analogie. Après une procédure de d’arrimage moléculaire classique, le classement a été réalisé en comparant les valeurs expérimentales et calculées des variations d’énergies de liaison pour des mutants alanines sur 11 positions de uPA. Pour quatre complexes un accord raisonnable est obtenu. Sur 10 des 11 positions, les valeurs de G calculées et expérimentales sont soit toutes les deux inférieures à 0.8 kcal/mol ou supérieures à 0.9 kcal/mol.
La Figure 25 montre la superposition du modèle uPAR/uPA avec la structure cristalline. L’écart entre les deux structures est en moyenne égal à 3.2 ± 0.5 Å sur les carbones et le L_rms est égal à 5.5±1 Å. Cette valeur élevée du L_rms est due à un mouvement de fermeture d’uPAR lorsqu’il se lie à uPA qui n’est pas observé lorsque qu’il se lie au peptide. La cavité de liaison de uPA est plus petite que celle du peptide. Ce mouvement charnière n’a pas été pris en compte dans notre procédure de l’époque. Néanmoins un des modèles est proche de la structure cristalline avec un L_rms égal à 3.5 Å. Enfin le I_rms est égal à 2.8 ± 0.3 Å, et le pourcentage de contacts natifs Fnat est égal à 33 ± 2 %. En conclusion les résidus les plus importants pour l’interaction uPAR /uPA sont correctement localisés.

Le récepteur hM1

Séquences peptidique

Les récepteurs muscariniques possèdent un court segment N terminal de 21 acides aminés avant la première hélice transmembranaire (Figure 26A). Il a été montré (Weill, Galzi et al. 1999) que l’absence de ce segment n’a aucune influence sur la liaison de ligands au récepteur. Une autre particularité des récepteurs muscariniques est la présence d’un grand domaine intracellulaire I3 (Figure 26A). Ce domaine d’une longueur de près de 180 acides aminés est situé entre les hélices transmembranaires 5 et 6. Des récepteurs muscariniques recombinants dans lesquels cette partie intracellulaire a été remplacée par une boucle plus courte (suppression des résidus 231 à 357) ont été construits et caractérisés par le groupe de B. Ilien (Weill, Galzi et al. 1999). Enfin, les sites de glycosylation ont également été mutés. Ces récepteurs recombinants possèdent toujours la capacité de lier leurs ligands et d’activer les protéines G. La séquence peptidique que nous utiliserons pour modéliser le hM1 est une forme avec le segment N-ter tronqué des résidus 1 à 20 ainsi que la forme courte de la boucle I3 décrite par Weill et al (Weill, Galzi et al. 1999) (Figure 26B).

Modélisation du cœur d’hélices

La rhodopsine était la seule structure de RCPG disponible au début de ce travail. Elle a donc été utilisée comme base pour construire un modèle du faisceau d’hélice du récepteur muscarinique par modélisation comparative. En dépit de valeurs d’identité de séquence relativement faibles entres les deux protéines (24% dans les hélices), leur alignement est peu ambiguë en raison de la présence de zones de forte conservation au sein des hélices (Baldwin, Schertler et al. 1997).

Prédiction des boucles

La boucle E1 du récepteur hM1 a été modélisée par comparaison avec celle de la rhodopsine (Figure 27) avec laquelle elle possède une similarité raisonnable (30%). La présence du pont disulfure entre le résidu 178 de la boucle E2 et le résidu 98 appartenant à une hélice transmembranaire contraint la conformation de la base de la boucle dans une conformation similaire à celle de la rhodopsine. Ces résidus sont donc également modélisés par homologie. En revanche, la structure de la rhodopsine ne constitue pas un modèle convenable pour prédire les conformations de l’extrémité de la boucle E2 ainsi que de la boucle E3. L’extrémité de la boucle E2 (169-177) a donc été prédite entièrement de novo avec l’aide du programme RAPPER (Furnham, Dore et al. 2006). Pour la boucle E3 (391-396) le programme RAPPER a identifié un fragment dans la PDB (code 1KQF) afin de guider la prédiction. Les 38 molécules d’eau internes de la structure cristallographique de la rhodopsine ont été également conservées dans le modèle de hM1 (Figure 28).
Le modèle final a été évalué par le serveur RAMPAGE (Lovell, Davis et al. 2003). On observe Figure 29 que 98% des résidus se trouvent dans les régions autorisées du diagramme de Ramachandran (Ramachandran, Ramakrishnan et al. 1963). Ce modèle ne présente donc aucun défaut majeur dans sa géométrie.

La toxine MT7

Les toxines modifiées sont produites par G. Mourier. Les structures cristallographiques des toxines MT7 modifiées ont été déterminées par E. Stura et R. Menez (CEA, SIMOPRO).
La cristallisation de la toxine MT7 sauvage n’a toutefois pas permis d’obtenir de cristaux de bonne qualité diffractant à des résolutions inférieures à 3 Å. En revanche, deux formes modifiées de la toxine ont pu être cristallisées et leur structures déterminées :
• Une forme portant deux atomes d’iode sur la boucle III au niveau de la tyrosine 51 et diffractant à une résolution de 1.42Å (Figure 30A)
• Une chimère MT7/MT1 constituée de la boucle I de la toxine MT1 et des boucles II et III natives de la toxine MT7. La structure de cette chimère a pu être déterminée avec une résolution de 1.25 Å (Figure 30B)
L’encombrement stérique des atomes d’iode est important et la structure de la MT7-di-iodée présente des contacts cristallins au niveau de la boucle III. Cependant, la comparaison des boucles II et III des structures de la toxine di-iodée et de la chimère démontre que les changements conformationnels dus à la greffe de l’atome d’iode sur la Tyr51 sont en fait très limités puisque l’écart entre les squelettes des toxines à l’exception de la boucle I (résidus 1-4 et 17-65) est seulement de 0.93Å.
On observe pour la structure de la chimère MT7/MT1 une conformation de la boucle I qui montre une disruption de l’interface entre les brins des boucles I et II. La chimère diverge nettement (écart de 3.5 Å) sur la conformation de la boucle I de la MT7-di-iodée et de la MT2 (Figure 31) qui présente une boucle I positionnée comme dans l’ensemble des protéines adoptant un repliement à trois doigts (Gilquin, Bourgoin et al. 2003).
Un modèle de la structure de la toxine a donc été obtenu en fusionnant avec MODELLER v8.2 les deux structures cristallographiques. Nous avons utilisé d’une part les coordonnées des boucles I de la toxine di-iodée (résidus 5 à 16), et d’autre part, les boucles II et III de la chimère (résidus 1 à 4 and 17 à 65). Ceci nous permet au final de disposer d’un modèle fiable de notre ligand et de nous affranchir d’éventuels artefacts structuraux dus à la présence d’iode ou à la greffe de la boucle d’une autre toxine.

Mesures thermodynamiques hM1/MT7

Les expériences de mutagénèse et les mesures thermodynamiques ont été réalisées par le groupe de Denis Servent (CEA SIMOPRO).

Modèle du complexe ternaire

Proposé initialement pour décrire le comportement d’un RCPG liant à la fois son ligand orthostérique et une protéine G (De Lean, Stadel et al. 1980), le modèle du complexe ternaire (TCM) peut en fait être généralisé à tout récepteur liant simultanément son ligand orthostérique et un autre ligand dans un second site topographiquement différent. Dans ce modèle, on ne considère qu’un seul état d’activation du récepteur auquel peuvent simultanément se lier un ligand orthostérique A et un ligand allostérique X avec des affinités respectives pour le récepteur libre KA et KX. La conséquence de la liaison d’un des ligands au récepteur est d’altérer les cinétiques d’association et de dissociation de l’autre ligand. La différence d’affinité du ligand orthostérique pour le récepteur libre ou lié au ligand allostérique définit la coopérativité du système noté α. Un facteur α>1, α<1 ou α=1 indique respectivement une coopérativité positive, négative ou neutre. Ainsi, le modèle du complexe ternaire, permet de modéliser correctement l’action de la plupart des modulateurs allostériques.
La NMS est un antagoniste du récepteur muscarinique. Elle se lie au site orthostérique et n’entre donc pas en compétition avec la toxine qui est un ligand allostérique. Fruchart-Gaillard et al ont montré que l’utilisation du modèle du TCM pour traiter les résultats d’expérience de compétition à l’équilibre était valable dans ce contexte (Fruchart-Gaillard, Mourier et al. 2006).

Alanine scanning des partenaires

Toutes les mesures de liaison du système hM1/MT7 décrite dans ce document ont été réalisées par l’équipe de Denis Servent (CEA/SIMOPRO).

Modifications de la toxine

Les résidus modifiés de la toxine ont été remplacés par des résidus alanine, afin d’étudier l’effet de leur chaîne latérale. Les toxines modifiées sont produites par synthèse chimique, de la même manière que la toxine sauvage (Mourier, Dutertre et al. 2003). Afin d’évaluer l’effet de ces modifications sur la structure globale de la toxine, le spectre de dichroïsme circulaire de chaque mutant a été comparé au spectre de la toxine MT7 sauvage. Tous ces spectres présentent une signature typique d’un feuillet β et indiquent que les diverses modifications en alanine ne semblent pas perturber la structure secondaire de la toxine.
Compte tenu des données disponibles dans la littérature, les positions modifiées ont été choisies en priorité au niveau des extrémités des boucles de la toxine, sur les deux faces. Les modifications concernent d’une part des résidus très conservés dans la famille tels que Ser8, Tyr30 et Lys48, qui pourraient être responsables de l’affinité des toxines pour les récepteurs muscariniques. D’autre part, des résidus spécifiques de la toxine MT7 tels que Lys5, Trp10, Phe11, Ser32, Met35 et Tyr51 ont également été modifiés pour tenter d’expliquer la forte sélectivité de la MT7 pour le hM1. Au final, 12 positions ont été modifiées (Figure 35) : Lys5, Ser8, Trp10 et Phe11 sur la boucle I, Tyr30, Ser32, Arg34, Met35 et Tyr36 sur la boucle II et Lys48, Tyr51 et Arg52 sur la boucle III de la toxine. Le seuil de variation minimale l’énergie de liaison pour considérer qu’une modification induit un changement significatif de est fixé à 1kcal.mol-1 d’après un traitement statistique des résultats par ANOVA. Les résultats obtenus (Figure 35) démontrent que les mutations aux positions 5, 8, 11, 30, 32, 48, 51 et 52 n’affectent pas significativement la liaison de la toxine sur le récepteur. Un second groupe de modifications W10A, M35A et Y36A induisent un effet significatif mais inférieur à un facteur 10 sur l’affinité de la toxine. Le résidu ayant de loin l’effet le plus marqué est l’arginine 34 dont la modification provoque une réduction d’affinité de près de 200 fois. Ce résultat indique clairement que cette chaîne latérale, centrale dans la structure de la toxine joue un rôle majeur dans la liaison de la toxine au récepteur. Les résidus modifiés sont représentés en bâtonnet sur la Figure 36. On peut constater que les extrémités des 3 boucles de la toxine sont impliquées dans la liaison au récepteur. Le cœur de l’interaction est l’arginine 34 qui est conservée chez les toxines muscariniques ainsi que la Tyr36 également conservée. Plus en périphérie, et notamment au niveau de la boucle I, on trouve des résidus impliqués dans l’interaction, mais spécifique de la MT7.

Table des matières

Chapitre 1: Introduction
1.1. Préambule
1.2. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)
1.2.1. Introduction à la signalisation cellulaire
1.2.2. Découverte et importance des récepteurs couplés aux protéines G
1.2.3. Couplage aux protéines G
1.2.4. Classification des RCPG
1.2.5. Structure des RCPG
1.2.5.1. Structure de la rhodopsine
1.2.5.2. Structure du récepteur -adrénergique
1.2.5.3. Conclusion
1.2.6. Les différents modes de liaison des ligands des RCPG
1.2.7. Oligomérisation des RCPG
1.3. Modélisation des RCPG
1.3.1. Modélisation comparative
1.3.2. Retour d’expérience sur les modèles par homologie de RCPG
1.3.2.1. Modèles de la rhodopsine
1.3.2.2. Modèles de 2AR
1.3.2.3. Criblage in silico de RCPG
1.3.3. Modélisation de novo
1.4. Les récepteurs muscariniques
1.4.1. Sous-types de récepteurs muscariniques
1.4.2. Le sous-type 1 des récepteurs muscariniques
1.4.3. Caractérisation des sites de liaison des récepteurs muscariniques
1.4.3.1. Site orthostérique
1.4.3.2. Site allostérique
1.5. Les toxines muscariniques
1.5.1. Synthèse
1.5.2. Structure
1.5.3. L’interaction toxine MT7 – récepteur hM1
1.6. Prédiction de la structure des complexes protéine-protéine
1.6.1. Nature des interfaces des complexes macromoléculaires
1.6.1.1. Nature des résidus
1.6.1.2. Dimension des interfaces de protéines
1.6.1.3. Réarrangements structuraux
1.6.2. Prédiction de la structure des complexes de protéine
1.6.3. Comparaison des méthodes de docking : le concours CAPRI
1.6.4. Méthode des cycles de doubles mutants
1.6.4.1. Principe
1.6.5. Validation de l’utilisation des données de doubles mutant pour le docking
1.6.5.1. Evaluation du modèle Ach-7/-cobratoxine
1.6.5.2. Evaluation du modèle du canal potassique Kv1.1/BgK
1.6.5.3. Evaluation du modèle uPAR/uPA.GFD
1.6.6. Conclusion
Chapitre 2: Étude structurale des partenaires
2.1. Le récepteur hM1
2.1.1. Séquences peptidique
2.1.2. Modélisation du cœur d’hélices
2.1.3. Prédiction des boucles
2.2. La toxine MT7
Chapitre 3: Prédiction de la structure du complexe hM1/MT7 
3.1. Mesures thermodynamiques hM1/MT7
3.1.1. Modèle du complexe ternaire
3.1.2. Alanine scanning des partenaires
3.1.2.1. Modifications de la toxine
3.1.2.2. Mutagénèse du récepteur
3.1.3. Cycles de doubles mutants sur le système hM1/MT7
3.1.3.1. Choix des couples de résidus
3.1.3.2. Résultats des expériences de cycles de doubles mutants
3.2. Exploration de la flexibilité conformationnelle
3.2.1. Dynamique moléculaire de la toxine
Dynamique moléculaire du récepteur
3.2.1.1. La boucle extracellulaire E2
3.2.1.2. La méthode PEDC
3.2.1.3. Dynamique moléculaire du récepteur
3.3. Procédure d’arrimage moléculaire des partenaires
3.3.1.1. Dynamique moléculaire
3.3.1.2. Échantillonnage des positions de départ
3.3.1.3. Introduction des données expérimentales
3.3.1.4. Utilisation de la dynamique moléculaire en 4D
3.3.1.5. Conclusion
3.4. Topologie des contraintes
3.5. Premiers modèles
3.5.1.1. Vers un dimère de récepteur
3.6. Démonstration expérimentale de l’existence de dimère de hM1
3.6.1. Expériences de gels natif
3.6.2. Transfert de fluorescence par photo-blanchiment de l’accepteur
3.6.3. Expérience d’anisotropie de fluorescence
3.6.4. Conclusion
3.7. Modèles trimériques du complexe dimère de hM1 / MT7
3.7.1. Construction d’un modèle de dimère de hM1
Chapitre 4: Validation et optimisation du modèle
4.1. Introduction
4.1.1. Dynamique moléculaire des RCPG
4.1.1.1. Travaux méthodologiques
4.1.1.2. Activation de la rhodopsine
4.1.1.3. Modèles
4.1.2. Effets électrostatiques et protéines
4.1.2.1. Seuils de distance sphériques
4.1.2.2. Particle Mesh Ewald
4.1.2.3. Équation de Poisson Boltzmann
4.1.3. Insertion du complexe dans une membrane
4.2. Dynamique moléculaire du modèle
4.3. Validation du modèle par recalculs d’énergie libre
4.4. Analyse du modèle MT7/dimère de hM1
4.4.1. Interface de dimérisation
4.4.2. Site de liaison de la toxine
4.4.2.1. Interface MT7/hM1A
4.4.2.2. Interface MT7/hM1B
Chapitre 5: Discussion
5.1. Apports et limites de la dynamique moléculaire
5.1.1. Influence de la boucle E2
5.1.2. Données non prises en comptes
5.1.2.1. W91M1 / Y30tox R52tox / W400M1
5.2. Dimérisation des récepteurs muscariniques
5.2.1. Nature de la surface d’interaction
5.2.2. Mode d’assemblage du dimère de récepteurs
5.2.3. Oligomères d’ordre supérieurs
5.3. Bases moléculaire des propriétés pharmacologiques de la toxine
5.3.1. Site de liaison
5.3.2. Stoechiométrie NMS / MT7 / hM1
5.3.2.1. Hypothèse 1 : 1 dimère de M1, 1 toxine, 1 NMS
5.3.2.2. Hypothèse 2 : 1 dimère de M1, 2 toxines, 2 NMS
5.3.3. Haute affinité de liaison
5.3.4. Sélectivité pour le sous-type M1 des récepteurs muscariniques
Chapitre 6: Conclusion et Perspectives
6.1. Perspectives : les bases moléculaires de l’allostérie
Chapitre 7: Index des figures
Chapitre 8: Bibliographie
Chapitre 9: Annexes
9.1.1. ligands orthostériques des RCPG
9.1.2. Alignement des séquences du hM1 et de la rhodopsine
9.1.3. Simulation d’arrimage
9.1.4. Simulation de dynamique moléculaire activée
9.1.5. Simulations de dynamique moléculaire dans la membrane

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