POURRITURE BRUNE DE LA POMME DE TERRE

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POURRITURE BRUNE DE LA POMME DE TERRE

GENERALITES

A Madagascar, la principale maladie qui attaque la pomme de terre pendant sa végétation est la bactériose vasculaire ou pourriture brune due à Ralstonia solanacearum. Cette maladie a été signalée pour la première fois,à la station agricole de Nanisana en 1929 notamment sur le cultivar Kidney (81).

SYMPTOMES

Sur les parties aériennes, cette maladie provoque les symptômes caractéristiques des maladies vasculaires dont le flétrissement brusque et rapide du feuillage précédé ou non de jaunissement, commençant par quelques feuilles et u ne tige, suivi d’un dessèchement.
Ces symptômes peuvent apparaître à tous les stades de développement de la pomme de terre. Si la maladie évolue très vite, on peut assister à une fanaison des feuilles sans enroulement des bords de leurs folioles, qui se décolorent en vert pâle puis en brun et ceci avant que les tubercules aient atteint leur grosseur normale.
Sur la partie souterraine, la maladie, dans les dernières phases de son évolution détermine une pourriture brune des tubercules qui pourrissent soit dans la terre soit pendant le stockage. Les tubercules coupés montrent que l’anneau vasculaire est coloré en brun clair et il en sort un exsudat muqueux, brunâtre et filant lors qu’on exerce une pression. Il en est de même pour les yeux et l’ombilic (40, 52).

REPARTITION

Actuellement, cette maladie existe dans tous les bassins de production. Elle sévit lors de la saison des pluies mais elle est absente sur les cultures de contre-saison sur rizière. La fréquence est plus rare sur les terrains volcaniques (42, 57).

DISSEMINATION ET MOYENS DE LUTTE

La pourriture brune est une maladie qui se propage facilement. Le plant contaminé constitue la principale source d’inoculum mais la maladie se transmet également par les semences, l’eau de ruissellement, l’eau de surface , les résidus de culture, les instruments et outils de culture contaminés, les mauvaises herbes…
Les moyens de lutte préconisés à titre préventif sont constitués par la combinaison des pratiques culturales dont les rotations de culture, l’élimination des plants contaminés, la désinfection des sols, la désinfection des instruments de culture, l’utilisation de semences saines, l’utilisation de cultivars tolérants ou résistants… (17, 72bis, 81)

AGENT ETIOLOGIQUE

La pourriture brune de la pomme de terre est due à la bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum.
Ralstonia solanacearum est un bâtonnet court aux extrémités arrondies, mesurant 1,5 à 2,5µm de long et 0,5 à 0,7µm de diamètre, mobile gr âce à 1 à 4 flagelles polaires, dépourvu de spore et de capsule (33, 47, 55).
Cette bactérie est chimioorganotrophe ; elle tire son énergie à partir de la dégradation des substances organiques. Elle est aérobie et son métabolisme respiratoire utilise l’oxygène comme accepteur d’électrons. Elle est capable de croître sur des milieux minima contenant des substrats divers intervenant comme seule source de carbone tels que l’acétate, le lactate et le citrate…Elle métabolise les sucres en produisant de l’acide (45, 62, 72).
Par ailleurs, elle est capable de réduire les nitrites en nitrates grâce à la présence de la nitrite réductase mais incapable de réduire les nitrates en gaz ammoniac, faute de nitrate réductase. Dans l’ensemble des Pseudomonas, Ralstonia solanacearum appartient au groupe des «Pseudomonas fluorescents», ne métabolisant pas le D-arabinose et accumulant le poly-β-hydroxybutyrate dans ses vacuoles comme substance de réserve (15, 62).
Elle ne produit pas d’indole, n’hydrolyse pas l’ami don et ne liquéfie pas la gélatine. Elle est capable de produire des pigments hydrosolubles, diffusibles sur des milieux de culture complexes. La marge de température pour sa croissance se situe entre 4 et 41°C. La bactérie est sensible à la dessiccation et à la salinité, même à des concentrations faibles de NaCl dans les bouillons de culture (42, 62, 72).
Les souches de Ralstonia solanacearum sont généralement divisées en 5 races, en fonction des spécificités respectives des plantes ôtesh (8), et en 5 biovars selon les caractéristiques biochimiques notamment l’utilisation de certains hydrates de carbone (32).
la race 1 comprend les souches pathogènes pour un grand nombre d’espèces végétales cultivées ou non dont la plupart appartenant à la Famille des Solanacées. Ces plantes hôtes comprennent entre autres : le tabac, la tomate, la pomme de terre, le géranium rosat, l’arachide, l’aubergine …
la race 2 pathogène de banane diploïde est responsable de la maladie connue sous
le nom de « Moko disease » en Amérique latine.
la race 3 adaptée aux températures fraîches d’altitude ( >1000m) est inféodée à la pomme de terre.
les races 4 et 5 attaquent respectivement le gingembre et le mûrier.
Jusqu’à présent, les souches de Ralstonia solanacearum isolées à Madagascar appartiennent uniquement à la race 1 de Buddenhagen et au biovar 1 de Hayward (71, 72, 75, 76).

LA GRANDE CONSOUDE

HISTORIQUE

Originaire de l’Europe et de l’Asie, la grande cons oude a été introduite à Madagascar vers la fin des années 80 par les religieuses du Centre Artisanal de Promotion Rurale (CAPR) Tsinjoezaka de Fianarantsoa, lesquelles étaient fortement intéressées par ses diverses utilisations et ses effets multiples en Europe. Outre l’utilisation de la grande consoude comme plante médicinale, le CAPR Tsinjoezaka avait mené,de façon empirique, des tests pour l’application de ses feuilles en agriculture, soit comme engrais vert, soit comme engrais liquide, soit comme produit biologique de traitement phytosanitaire (insecticide ou insectifuge). La grande consoude, riche en élémentsminéraux s’est avérée un excellent fertilisant et intéressa plusieurs Organismes du Secteur agricole. C’est ainsi que, dans le cadre du Projet National de Vulgarisation Agricole, la Zone de vulgarisation agricole d’Antananarivo Atsimondrano était chargée de procéder à la multiplication à grande échelle de cette plante au Centre de Multiplication et d’Appui Technique d’Ambodivary Ambatofotsy (77).
La photo N°1 présente une des parcelles de culture de Symphytum officinale uplandicum destiné à être utilisé comme engrais biologique.

SYSTEMATIQUE

La grande consoude appartient à la Famille des Borr aginacées, au genreSymphytum et à l’espèce officinale. Elle possède plusieurs synonymes français dont entre autres : herbe aux charpentiers, console, oreille d’âne, langue de vac he…(63)

BOTANIQUE

La grande consoude est une plante herbacée, vivace,atteignant de 10 à 120cm de haut. Le système racinaire épais et charnu est constituépar un pivot central supportant de nombreuses ramifications. Les tiges ramifiées, dressées sont couvertes de poils blancs.
Les feuilles lancéolées, décurrentes (dont le limbese prolonge le long de la tige), pointues (celles de la base sont plus larges) sont rigides et couvertes d’un duvet. Elles sont de grande taille (jusqu’à 30cm de long pour une largeu r de 10 à 20cm).
Les fleurs hermaphrodites et pentamères sont en grappe de clochettes retombantes, généralement de couleur blanche mais pouvant êtreoses,r jaunes ou violacées (63, 66, 86).

MULTIPLICATION

La grande consoude peut se reproduire par semis mais les graines sont rarement produites.
La multiplication est plus aisée et rapide par voie végétative par division des touffes correspondant aux éclats de souche ou par des boutures racinaires.
La grande consoude n’est pas une plante très exigeante mais préfère les terrains humides sous les climats tropicaux ou subtropicaux (63).

UTILISATIONS :

La grande consoude est depuis longtemps très estimée pour sa propriété médicinale. En effet, c’est une plante réputée comme l’un des icatrisants les plus efficaces. La racine appliquée en usage externe sur les blessures, les ulcères, les contusions ou les brûlures a respectivement des propriétés cicatrisantes, émollientes (elle relâche et amollit les tissus) et astringentes (elle resserre et assèche les tissus grâce à la teneur en allantoïnes, mucilages et tanins).
En usage interne, la racine, la tige et les feuilles de la grande consoude ont des propriétés anti- diarrhéiques et pectorales (calmela toux) (44, 63, 66, 86).
Par ailleurs, la grande consoude s’avère être une onneb plante culinaire. Elle est consommée crue comme salade ou cuite comme brède.
Toutefois, la grande consoude est surtout recommandée en usage externe car elle renferme un alcaloïde, la symphytocynoglosine qui est toxique pour le foie et un glucoside, la consolidine qui entraîne une paralysie du système nerveux central et l’arrêt respiratoire (63).
En agriculture, les feuilles de la grande consoude peuvent être utilisées comme engrais vert ou après conversion en purin comme activateur de compost. En effet, les teneurs moyennes des matières sèches en N, P O , K O, Ca sont respectivement 3,46% ; 0,73% ; 7,28% ; 0,88% (77). A signaler qu’à Madagascar, dan s la commune rurale d’Ambohijanaka, les paysans ne cessent d’élargir leur culture de grande consoude en les utilisant à la fois comme haies vives de protection contre l’érosion tout au long des courbes de niveau des terrains en pente et comme source de biomasse pour l’engrais vert, le compostage et l’engrais liquide.
Par ailleurs, aux Etats-Unis, la grande consoude est récemment utilisée comme produit naturel fongicide contre la pyriculariose et la maladie des tâches brunes (29).

PREMIERE PARTIE EXPERIMENTATION EN POTS ET EN SERRE

Principe

Il consiste à :
– évaluer la résistance des plants en miniature mais matures, de pomme de terre transplantés sur du substrat constitué de sol artifciellement contaminé par des souches marquées de Ralstonia solanacearum. Deux traitements à l’engrais vert et à l’engrais liquide de grande consoude et des témoins non traités ont ervis de base de comparaison selon le taux de survie au bout de 30 jours.
-suivre les effets inhibiteurs éventuels des traitements sur la population de Ralstonia solanacearum dans le sol Matériel végét al
Il s’agit respectivement de :
-Semences saines de pomme de terre (cv Meva) moyennement sensibles à la pourriture brune, produites par la FIFAMANOR.
-Jeunes feuilles de grande consoude provenant des parcelles de culture du DRFP de la FO.FI.FA.
Souche bactérienne
Nous avons utilisé une souche de Ralstonia solanacearum, isolée à partir d’un plant d’aubergine et possédant un marqueur épidémiologique puissant dont la double résistance aux deux substances antimicrobiennes : la rifampicine et l’isoniazide.

Méthodes

Prospections sur terrain et prélèvement deplants flétris d’aubergine et de tomate

Dans un premier temps, nous avons fait une descente sur terrain au Centre de Multiplication de Semences de Laniera afin de rechercher des plants atteints de flétrissement bactérien en nous référant aux descriptions classiques spécifiques à chaque espèce de plante hôte (53, 54, 55, 81), et d’en prélever des échantillons qui seront ramenés en laboratoire.
Dans un second temps, nous avons procédé à l’isolement et à la caractérisation partielle du microorganisme contenu dans les échantillons adoptés afin de confirmer qu’il s’agit bien de Ralstonia solanacearum.

Technique

Lors de la descente sur terrain, les plants d’aubergine et de tomate atteints de flétrissement sont examinés attentivement. Des échantillons sont prélevés sur les plants présentant des symptômes assez avancés d’une attaque de Ralstonia solanacearum.
Ces échantillons, obtenus après déterrement des plantes hôtes, sont enveloppés dans des sachets plastiques, perforés pour limiter l’évapotranspiration au cours du transport vers le laboratoire (18). Après confirmation du diagnostic de la maladie, nous avons procédé à la détermination de l’agent étiologique.

Isolement de l’agent étiologique

Pour l’identification du microorganisme responsable, nous avons procédé à l’isolement des souches prélevées sur des plants malades et à la caractérisation partielle.

Isolement des souches de Ralstonia solanacearum à partir d’une tige infectée

Principe

Le milieu semi-sélectif gélosé de Kelman avec du chlorure de triphényltetrazolium + (TTC), complémenté de 1g de levure (milieu KY), est utilisé pour l’isolement et la purification des souches de Ralstonia solanacearum. La composition pour 1 litre de ce milieu est donnée en annexe 1.
Les souches de Ralstonia solanacearum, différenciées selon leur virulence et leur capacité à réduire le TTC en Triphényl formazan, decouleur rouge, forment sur ce milieu deux colonies typiques, à caractéristiques différentes : colonies avirulentes et colonies virulentes. Les souches virulentes sont sélectionnées sur la base de leur fluidité, couleur, et forme des colonies (39).

Technique d’isolement

Préparation de suspension bactérienne à partird’exsudats bactériens

La tige infectée est coupée à 5cm du collet et sectionnée en biais à la base. Ce fragment de tige est ensuite désinfecté superficiellement par immersions successives dans une solution de chlorure mercurique à 0,1% pendant une minute, et dans une solution d’alcool éthylique à 70% pendant 10s. Les tubes contenant ces solutions sont placés à l’horizontal afin d’éviter tout risque d’exsudation éventuelle de bactéries.
Après quatre rinçages à l’eau distillée stérile, la tige est placée à la verticale dans un tube contenant 5 ml d’eau distillée stérile, pendant 12heures pour laisser les bactéries exsuder.

Ensemencement

La suspension bactérienne préparée est ensuite ensemencée sur le milieu KY contenu dans des boîtes de Pétri, par des stries transversales de manière à obtenir des colonies isolées. Les boîtes ont été mises à l’étuve à 30°C.

Caractérisation et Identification partielles de souches de Ralstonia solanacearum

L’identification d’une souche bactérienne repose sur la comparaison de ses caractères phénotypiques, c’est-à-dire les expressions des caractères génotypiques avec ceux des souches de référence, disposées dans les matrices d’identification.
Nous avons procédé à l’étude des caractéristiques orphologiques,m culturales et physiologiques d’une souche virulente provenant de chaque échantillon adopté.

Etude des caractéristiques culturales etmorphologiques

Cette étude est réalisée respectivement par examenmicroscopique et macroscopique.

Examen macroscopique

Il s’agit d’un examen à l’œil nu des colonies bacté riennes.

Principe

Chaque espèce bactérienne en croissance sur un milieu gélosé standard homogène, forme des colonies à type caractéristique qui lui est propre (spécifique).

Technique

Nous avons étudié l’aspect des colonies sur le milieu KY+ après 48 heures d’incubation à 30°C.

Examen microscopique

Nous avons observé au microscope les bactéries à l’état frais et après coloration de GRAM.

Examen à l’état frais

Cet examen permet de mettre en évidence, la forme des bactéries, leur mode de groupement, leur mobilité et le type de ciliature.

Principe

Il s’agit d’observer directement les bactéries vivantes, en l’absence de fixation et de coloration, dans une goutte de liquide déposée entr lame et lamelle.

Technique

Les prélèvements sont dilués préalablement dans del’eau distillée stérile et mis en suspension dans un peu d’eau distillée stérile avant l’observation réalisée à l’aide de l’objectif x 40 d’un microscope LEISS .

Examen après coloration de GRAM

La coloration de Gram est la coloration de base des bactéries. Cet examen permet de voir la morphologie générale des cellules et de déterminer le type de bactérie selon la structure de la paroi.

Principe

C’est une coloration différentielle basée sur l’afinité tinctoriale des bactéries vis-à-vis du violet de gentiane. Les bactéries GRAM-négatives sont colorées en rose et les bactéries GRAM- positives en violet.
Les facteurs qui interviennent dans cette coloration sont :
la différence de composition chimique des parois bactériennes dont dépendent les liaisons ioniques entre les groupements basiques du colorant et les groupements acides de la cellule, et la nature des micro-complexes formés ;
la différence de perméabilité des parois à l’alcoolet en conséquence la dissolution plus ou moins rapide des complexes formés.

Technique

La méthode de la coloration de GRAM nécessite plusieurs étapes : réalisation d’un frottis, coloration, décoloration…(cf annexe 5)

Test d’utilisation des hydrates de carbone

L’utilisation des diholosides (lactose, maltose, cellobiose) et l’oxydation des hexoses alcools (mannitol, sorbitol, dulcitol) permettent de différencier les souches de Ralstonia solanacearum en 5 biovars :
biovar 1 : ce sont celles qui n’utilisent pas les diholosides et n’oxydent pas les hexoses alcools ; biovar 2 : ce sont celles qui utilisent les diholosides mais n’oxydent pas les alcools ; biovar 3 : ce sont celles qui utilisent les diholosides et oxydent les hexoses alcools ; biovar 4 : ce sont celles qui n’utilisent pas les diholosides mais oxydent les hexoses alcools ;
biovar 5 : ce sont celles qui utilisent les diholosides et oxydent uniquement le mannitol

Principe

L’étude de l’utilisation des hydrates de carbone s’effectue sur un milieu de base : le sel de Ayers, dont la composition pour 1l est donnée enannexe 1. L’utilisation de chaque hydrate de Carbone se traduit par une acidification du milieu faisant virer la couleur de l’indicateur de pH, le bleu de bromothymol, du vert olive au jaune.

Technique

Chaque hydrate de carbone est additionné au milieude base à la concentration finale de 0,1% (masse/volume).
Le dulcitol est additionné directement au milieu debase avant la stérilisation à 120°C pendant 20 minutes.
Les solutions de mannitol et sorbitol relativement thermostables sont stérilisées séparément à 110°C pendant 20 minutes.
Les solutions de lactose, maltose, cellobiose, thermolabiles ont été stérilisées par filtration sur membrane millipore 0,22 µm avant d’être additionnées au milieu refroidi à 60°C.
Les milieux ainsi préparés sont ensuite repartis dans des tubes stériles, inclinés à raison de 3 à 4 ml de milieu par tube, à l’aide d’u ne pipette Pasteur stérile.
L’ensemencement de chaque milieu est réalisé en versant 3 gouttes d’une suspension bactérienne laiteuse, préparée à partir de culturejeune sur milieu gélosé de Kelman.
Pour chaque hydrate de carbone, le test est répététrois fois en présence d’un témoin sans hydrate de carbone. Les cultures sont incubéesà 30°C. La croissance bactérienne et le virage éventuel de l’indicateur de pH ont été examinés pendant 14 jours.

Test de pathogénicité

Ce test a pour but de mettre en évidence le pouvoir phytopathogène des souches bactériennes isolées et purifiées. Il permet égalentm de différencier les races de Ralstonia solanacearum.

Principe

Il s’agit de vérifier si les souches virulentes sélectionnées et purifiées peuvent provoquer le flétrissement de plantes hôtes saines (pomme de terre), lorsqu’elles sont placées dans des conditions favorables (Postulat de KOCH) (18).

Table des matières

I- INTRODUCTION
II- RESUME BIBLIOGRAPHIQUE
II-1 LA POMME DE TERRE
II-1-1 Origine et Historique
II-1-2 Bassins de production
II-1-3 Saisons de culture
II-1-4 Botanique
II-1-5 Cycle végétatif
II-1-6 Physiologie
II-1-7 Valeur biologique
II-1-8 Variétés
II-1-9 Epidémiologie
II-1-10 Systématique
II-2 POURRITURE BRUNE DE LA POMME DE TERRE
II-2-1 Généralités
II-2-2 Symptômes
II-2-3 Répartition
II-2-4 Dissémination et moyens de lutte
II-2-5 Agent étiologique
II-3 GRANDE CONSOUDE
II-3-1 Historique
II-3-2 Systématique
II-3-3 Botanique
II-3-4 Multiplication
II-3-5 Utilisations
III- PREMIERE PARTIE ET EN SERRE
III-1 Principe
III-2 Méthodes
III-2-1 Prospection sur terrain et prélèvement de plants flétris d’aubergine et de tomate
III-2-2 Isolement de l’agent étiologique
III-2- 2-1 Isolement des souches de Ralstonia solanacearum à partir d’une tige infectée
B-1 Préparation de suspension bactérienne à partir d’exsudat bactérien
B-2 Ensemencement
III-2-3 Caractérisation et identification partielles de souches de Ralstonia solanacearum
III-2-3-1 Etude des caractéristiques culturales et morphologiques
A- Examen macroscopique
B- Examen microscopique
B-1 Examen à l’état frais
B-2 Examen après coloration de GRAM
III-2-3-2 Test d’utilisation des hydrates de carbone
III-2-3-3 Test de pathogénicité
A-Principe
B-Technique
B-1 Culture des plants miniatures de pomme de terre
B-2 Inoculation artificielle des souches bactériennes
III-2-4 Conduite d’essais en pots et en serre
III-2-4-1 Prélèvement de sol et analyse physico-chimique
A-Détermination du taux d’hydratation (taux d’humidité)
B- Mesure du pH
III-2-4-2 Culture des plants miniatures mais matures de pomme de terre
A- Obtention des souches marquées
B- Préparation du purin de grande consoude
C- Incorporation de l’inoculum et des traitements
III-2-4-3 Numération de Ralstonia solanacearum dans le sol
B-1 Prélèvement et échantillonnage
B-2 Préparation de suspensions-dilutions de terre
B-3 Ensemencement
B-4 Lecture
III-3 Résultats et discussions
III-3-1 Diagnostic visuel sur terrain
III-3-2 Diagnostic en laboratoire
III-3-3 Isolement et caractérisation partielle des souches de Ralstonia solanacearum
III-3-3-1 Caractères culturaux et morphologiques
III-3-3-2 Détermination du type de biovar
III-3-3-3 Test de pathogénicité
III-3-4 Essais d’expérimentation en pots et en serre
III-3-4-1 Cultures hors-sol des plants miniatures de pomme de terre
III-3-4-2 Taux de flétrissement des plants de pomme de terre
III-3-4-3 Numération des souches de Ralstonia solanacearum
CONCLUSION PARTIELLE
IV-DEUXIEME PARTIE STATION AGRICOLE
IV-1 Principe
IV-2 Méthodes
IV-2-1 Culture de la grande consoude
A- But
B- Principe
C- Technique
C-1 Obtention des éclats de souches de grande consoude
C-2 Mise en place de la parcelle
C-3 Entretien
C-4 Récolte
IV-2-2 Culture de la pomme de terre et apport des traitements
IV-2-3 Analyse chimique et microbiologique des sols
IV-2-3-1 Prélèvement de sol et échantillonnage
A- Principe
B- Technique
B-1 Prélèvement de sol dans la jachère nue
B-2 Prélèvement de sols au voisinage de la plante cultivée
B-3 Prélèvement de sols lors de la récolte
IV-2-3-2 Réduction et conservation de l’échantillon de sol
IV-2-3-3 Méthode de dilution en boîte de Pétri
A- Détection et numération des souches de Ralstonia solanacearum
A-1 Ensemencement
A-2 Lecture
A-3 Détermination du type de biovar
A-4 Test de pathogénicité
B- Numération de la microflore totale
B-1 Préparation de l’extrait de terre
B-2 Ensemencement
B-3 Lecture
C- Numération des bactéries
C-1 Ensemencement
C-2 Lecture
D- Numération des actinomycètes
D-1 Ensemencement
D-2 Lecture
E- Numération des champignons
E-1 Ensemencement
E-2 Lecture
IV-2-3-4 Méthode du nombre le plus probable
A- Détermination du nombre caractéristique (3 chiffres)
B- Détermination du nombre le plus probable de germes
C- Tracé des courbes d’activité biologique
D- Numération des germes ammonificateurs
D-1 Principe
D-2 Ensemencement
D-3 Lecture
E- Numération des germes protéolytiques
E-1 Principe
E-2 Ensemencement
E-3 Lecture
F- Numération des germes nitrificateurs (nitreux et nitriques)
F-1 Principe
F-2 Ensemencement
F-3 Lecture
F-3-1 Mise en évidence de la présence des nitrites
F-3-2 Mise en évidence de la présence des nitrates
G- Numération des germes dénitrificateurs
G-1 Principe
G-2 Ensemencement
G-3 Lecture
IV-5 RESULTATS ET DISCUSSIONS
IV-5-1 Taux de flétrissement des plants de pomme de terre
IV-5-2 Analyse chimique et microbiologique des sols
IV-5-2-1 Caractéristiques du sol de la jachère nue
IV-5-2-2 Evolution du pH
IV-5-2-3 Evolution du taux d’humidité
IV-5-2-4 Evolution de la population de Ralstonia solanacearum dans le sol
IV-5-2-5 Evolution des principaux groupes de la microflore tellurique
A- Evolution de la microflore totale
B- Evolution des bactéries
C- Evolution des actinomycètes
D- Evolution des champignons
IV-5-2-6 Evolution des groupements fonctionnels du cycle de l’azote
A- Evolution des ferments ammonificateurs
B- Evolution des protéolytiques
C- Evolution des ferments nitrificateurs
D- Evolution des ferments dénitrificateurs
V- CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
VI- BIBLIOGRAPHIE
VII- ANNEXES

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