Soutenance mémoire
Les thérapies cellulaires
Le principe d’une thérapie cellulaire est que les cellules médicaments sont greffées chez le patient. Elles peuvent être directement mises au niveau de l’organe défectueux , ou bien être injectées dans la circulation sanguine, et se greffer elles-mêmes sur l’organe cible.
Actuellement les thérapies cellulaires les mieux maîtrisées et effectuées fréquemment concernent les cellules sanguines. Cela est probablement dû à la structure liquide (contrairement à l’organisation 3D complexe des autres organes) et à la facilité d’accès et de prélèvement de cet organe. Les cellules médicaments sont les cellules souches hématopoïétiques, CSH. Ce traitement est utilisé en cas de leucémie (cancer affectant les CSH). Elles peuvent être prélevées sur le patient lui même, dans ce cas c’est une greffe autologue, ou bien provenir d’un donneur compatible, dans ce cas c’est une greffe allogénique. Les CSH sont récupérées par un prélèvement sanguin ou bien de moelle osseuse qui contient en majorité des globules rouges, des plaquettes et des globules blancs. Au cours du traitement, les CSH sont injectées dans la circulation sanguine du patient, afin de coloniser la moelle osseuse (lieu de production des cellules sanguine par les CSH).
Il y a environ 5.10⁴ greffes de CSH par an dans le monde. Les thérapies cellulaires sont donc des traitements encore peu répandus. Mais de nombreux essais cliniques sont en cours dans le but de développer la médecine régénérative. C’est le cas par exemple d’une start up française CellProthera, créée en 2008 par le Pr. Hénon, qui propose de traiter l’infarctus du myocarde par une injection de CSH. Après un infarctus, les CSH du patient sont récupérées. Ces cellules sont amplifiées puis réinjectées dans la circulation sanguine.
L’objectif à long terme de la médecine régénérative serait d’avoir à disposition des stocks de cellules d’intérêts thérapeutiques. Dès qu’un patient aurait besoin d’une greffe, ces banques de cellules seraient sollicitées. Le processus compliqué et limitant du don d’organe ou de recherche de donneur n’aurait plus lieu d’être.
La première étape est la génération de lignées cellulaires universelles de cellules souches pluripotentes, stables et de grade clinique. Le terme « universelle » signifie qu’elles sont compatibles avec tous les systèmes HLA (Human Leucocyte Antigen). Ces lignées seraient produites à partir de cellules souches embryonnaires, ou d’iPS. Elles seraient ensuite stockées dans des banques cellulaires, qui permettraient de lancer une ligne de production. La première étape de production serait l’amplification des cellules souches pour obtenir entre 100 et 1000 milliards de cellules. Ces cellules seraient ensuite différenciées dans le type cellulaire désiré.
L’approvisionnement de la matière première, en l’occurrence les cellules souches pluripotentes, est une question importante lorsqu’une production à grande échelle est lancée. Des équipes ont travaillé sur la génération d’iPS sans recourir à la reprogrammation génétique, mais grâce à l’action de quelques molécules . Cela rend leur production plus adaptée à une utilisation clinique du point de vue de la simplicité de production et de la sécurité . D’autres recherches sont menées sur les cellules souches embryonnaires pour dépasser les problèmes éthiques. Des études sont aussi en cours pour surmonter la barrière immunologique et les problèmes de compatibilité . Tout cela ouvre la voie à un approvisionnement à grande échelle en cellules souches. En parallèle, des recherches sont menées sur le stockage des cellules par cryopréservation , des protocoles de mise en culture, d’amplification et de différenciation dans des conditions de production cGMP (current Good Manufacturing Production), et sur leur mise en forme en tant que « médicament ».
La recherche scientifique sur les cellules souches essaye de relever petit à petit les challenges scientifiques et techniques, dont le tri cellulaire, pour le développement d’une médecine régénérative à grande échelle.
Pourquoi est-il nécessaire de trier les cellules ?
Le principe du tri cellulaire est d’isoler un type cellulaire à partir d’une suspension cellulaire hétérogène .
Le tri de cellules souches hématopoïétiques
Une des complications importantes à la suite d’une transplantation allogénique de CSH est l’apparition d’une réaction immunitaire du greffon contre l’hôte (Graft Versus Host Disease – GVHD). Dans ce cas les lymphocytes T du donneur présents dans le greffon attaquent les cellules du patient ayant reçu la greffe. C’est une cause importante de mortalité. Un moyen de lutter contre les GVHD est d’éliminer les lymphocytes T du greffon. Pour ça deux voies sont possibles : enlever spécifiquement les lymphocytes T, ou récupérer spécifiquement les CSH . Cependant le nombre de CSH greffées est un paramètre déterminant pour la réussite de la greffe, et certaines études suggèrent que cette phase de tri induit la perte d’un nombre important de CSH entrainant l’échec de la greffe . En outre la mise au point d’une technique de tri cellulaire efficace, réduisant la réaction immunitaire du greffon, permettrait d’augmenter les chances de trouver un donneur en réduisant les contraintes de compatibilité entre le donneur et le receveur .
Le tri cellulaire est donc un processus essentiel pour l’amélioration du traitement des leucémies en réduisant les complications (pouvant être mortelles) après une transplantation, et en augmentant les chances de trouver un donneur. Le site gouvernemental américain clinicaltrials.gov dénombre 31 études cliniques dans ce domaine. Cette application médicale nécessite une méthode de tri avec un rendement et une pureté importants pour obtenir un greffon avec le maximum de CSH et le minimum de lymphocyte T. Pour un adulte il est nécessaire de récupérer de l’ordre de 1.10⁸ à 5.10⁸ CSH ce qui implique un rendement minimal de 65%. De plus ce sont des cellules rares, leur concentration sanguine est de 3.10⁴ CSH.mL-1, alors que la concentration en globules rouges est de 5.10⁹ cellules.mL-1. Les volumes des prélèvements sont de l’ordre de quelques centaines de millilitres, ce qui reste encore à l’échelle d’un laboratoire. Une contrainte importante est que le tri ne doit pas altérer l’état physiologique des cellules, elles doivent rester viables et fonctionnelles. L’ensemble du processus doit répondre à des exigences de stérilité, toxicité, biocompatibilité… Enfin le coût et la durée de la séparation ne doivent pas être prohibitifs.
La thérapie cellulaire à grande échelle
Lors de la production de cellules thérapeutiques, à l’issue de la phase de différenciation , la suspension cellulaire contient des cellules différenciées mais aussi des cellules indifférenciées. Le risque lié à la greffe de cellules indifférenciées est la formation de tératomes , qui est une formation tumorale pouvant être maligne. Il est donc indispensable de purifier la suspension cellulaire issue de la phase de différenciation.
Dans ce cas les volumes et les quantités de cellules d’intérêts en jeu sont 10 000 fois plus importants que pour les applications actuelles. Cela nécessite donc une méthode de séparation à grande échelle, c’est-à-dire pouvant traiter quelques centaines de litres de suspension cellulaire en un temps raisonnable, et pouvant récupérer des milliers de milliards de cellules. La pureté et le rendement du tri sont très importants pour s’assurer d’éliminer toutes les cellules potentiellement tumorigènes. Un autre aspect à prendre en compte est la simplicité d’utilisation. C’est un paramètre primordial dans le milieu industriel, car cela peut avoir un impact sur le coût final du produit. Plus la méthode est compliquée, plus la durée est importante, plus le personnel doit être qualifié, plus le risque d’erreur est grand…. A titre de comparaison il ne faut pas prendre le coût de production d’un médicament classique car dans le cas de la thérapie cellulaire grâce à une injection de cellule le malade est définitivement guéri. D’après l’INSERM, aujourd’hui le coût de production de cellules thérapeutiques pour un patient est autour de 15 000 euros. En cas d’infarctus du myocarde un traitement classique est la prise d’un comprimé de plavix par jour, ce qui revient à 300 euros par an, ou 3000 euros sur 10 ans, sans que le patient soit guéri. Le coût actuel des thérapies cellulaires n’est donc pas prohibitif et il devrait encore baisser avec le développement de la médecine régénérative à grande échelle.
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Table des matières
Introduction générale
1. Le tri cellulaire
1.1. Présentation du contexte biologique et médical
1.1.1. La médecine régénérative
Les cellules souches
Les thérapies cellulaires
Pourquoi est-il nécessaire de trier les cellules ?
1.1.2. Le diagnostic
1.1.3. Conclusion
1.2. Etat de l’art du tri cellulaire
1.2.1. Comment identifier une fonction biologique ?
1.2.2. Les méthodes de tri basées sur des critères physiques
La densité des cellules
La taille, la forme et la déformabilité des cellules
1.2.3. Le tri par affinité
Les anticorps
Fluorescence Assisted Cell Sorting – FACS
Magnetic Assisted Cell Sorting – MACS
La chromatographie d’affinité de cellules
1.3. Présentation de la méthode de tri cellulaire étudiée
1.3.1. Principe de la technique de tri
1.3.2. Description de l’interaction spécifique ligand-récepteur
Interaction spécifique entre deux molécules en solution
Interaction spécifique entre deux molécules attachées à des surfaces
Etape de rencontre en chromatographie d’affinité cellulaire
1.4. Conclusion
1.5. Bibliographie
2. Etude de l’étape de transport permettant aux cellules d’atteindre la surface des billes
2.1. Etude expérimentale de l’étape de transport
2.1.1. Système modèle
Interaction entre les billes d’alginate et les particules
Les billes d’alginate
Les particules magnétiques
2.1.2. Présentation du dispositif expérimental
2.1.3. Quantification de la capture
2.1.4. Résultats
Mesure de la capture en fonction du temps et détermination de la constante cinétique d’association kon
Cinétique d’association en fonction de la vitesse
Cinétique d’association en fonction de la taille des billes
Saturation de la surface des billes
2.1.5. Conclusion
2.2. Interprétation des résultats
2.2.1. Les phénomènes physiques à l’origine du transport des particules à proximité des billes
Présentation du modèle simplifié de Yao
Les interactions entre les surfaces
2.2.2. Interprétation des données expérimentales
2.2.3. Conclusion
2.3. Conclusion
2.4. Bibliographie
3. La capture spécifique
3.1. La fonctionnalisation des billes
3.1.1. Introduction
3.1.2. Fonctionnalisation des billes d’alginate
Le greffage de la streptavidine
La réactivité de la streptavidine greffée
3.1.3. Augmentation de la densité surfacique de fonctionnalisation
Le greffage de biotine sur des billes d’alginate
Le greffage de la streptavidine sur les billes de verre
3.1.4. Conclusion
3.2. La capture spécifique
3.2.1. Le système étudié
3.2.2. Montage expérimental et quantification de la cinétique de capture
3.2.3. Résultats et interprétation
Le système modèle
La capture grâce aux anticorps
3.2.4. Conclusion
3.3. La chromatographie cellulaire pour une application médicale à grande échelle
3.3.1. La section de la colonne
3.3.2. La concentration cellulaire
3.3.3. Le rayon des billes
3.3.4. La vitesse d’écoulement et la longueur de la colonne
Le tri de cellules souches après une phase d’amplification pour la thérapie cellulaire
Quels sont les avantages de la présence d’un écoulement ?
3.3.5. Conclusion
3.4. Conclusion
3.5. Bibliographie
4. Automate de tri cellulaire
4.1. Introduction
4.2. Description de l’automate de tri cellulaire développé par Bertin Technologies
4.2.1. La définition du cahier des charges
4.2.2. La zone de séparation contenant les billes pour la capture de cellules
4.2.3. L’automate dans son intégralité – stockage et distribution des différentes solutions
4.2.4. Séquence des étapes permettant de trier les cellules
4.3. Conformité de l’automate et retour d’expérience
4.3.1. Limitation de la perte des cellules dans les volumes morts
4.3.2. Montage des seringues, pousse-seringues et zone de séparation
4.4. Conclusion
4.5. Bibliographie
Conclusion générale
