Soutenance mémoire
Potentiel d’application de la lutte biologique en culture
Introduction:
Structure d’accueil:
L’institut de Recherche en Horticulture et Semences (IRHS) créé en 2012 par le regroupement de quatre unités (GenHort, PaVé, SAGAH et PMS), est une UMR (Unité Mixte de Recherche) sous la tutelle de l’INRA, l’Université d’Angers et Agrocampus Ouest. L’institut regroupe 13 équipes de recherche organisées en trois pôles : rosiers et plantes ornementales, fruits et légumes et semences. L’IRHS regroupe ainsi environ 240 personnes dont 175 permanents, que ce soit des chercheurs, enseignants-chercheurs, des ingénieurs de recherche et d’étude ou des techniciens, ainsi que des personnes en contrat temporaire, des doctorants et post-doctorants ou encore des stagiaires. Les recherches effectuées à l’IRHS utilisent des approches de physiologie/écophysiologie des plantes, de microbiologie, de génétique, ainsi que des approches transversales de phénotypage et de traitement des données -omiques grâce à la bio-informatique. L’IRHS mène également des recherches plus appliquées grâce à des projets développés en partenariat avec différents acteurs du secteur privé, notamment via la collaboration avec le pôle de compétitivité Végépolys . Les recherches menées à l’IRHS sont en partie financées par le RFI (Recherche, Formation et Innovation) Objectif Végétal, qui est un programme sur 5 ans développé sur l’initiative de la Région des Pays de la Loire pour alimenter la dynamique territoriale de recherche et d’innovation. Pour soutenir ce programme, la région Pays de la Loire et Angers Loire Métropole se sont engagés à allouer respectivement un budget de 4M et de 500 000 € sur 5 ans et l’Europe participe à hauteur de 800 000 à 1M€ via le Fonds Européens de Développement Régional (FEDER). Enfin, l’IRHS est l’une des unités porteuses de la SFR (Structure Fédérative de Recherche) QUASAV (QUAlité et SAnté du Végétal) qui a pour objectif de coordonner et dynamiser la recherche dans le domaine du végétal sur le site d’Angers .
Contexte scientifique:
La remise en cause de l’utilisation des pesticides s’est traduite par un renforcement au niveau européen de la législation des produits phytopharmaceutiques et par le retrait du marché de certains produits. A l’échelle nationale, le plan Ecophyto 2 vise à réduire l’usage des produits phytosanitaire de moitié d’ici 2025. L’objectif ici est de maintenir une agriculture de qualité avec un fort rendement, tout en s’inscrivant dans une dimension éco-responsable en favorisant l’utilisation de méthodes de lutte biologique L’équipe FungiSem travaille depuis plusieurs années sur les mécanismes contrôlant la transmission des champignons pathogènes aux semences, et notamment sur le rôle que pourraient avoir les interactions entre Alternaria brassicicola et la microflore associée aux semences de Brassicacées sur cette étape-clé du cycle infectieux du champignon. Dans le cadre du projet MetaSEED (2013-2017), il a été montré qu’A. brassicicola influe sur la composition du microbiote des semences de radis : il diminue l’abondance de certaines espèces de champignons saprophytes, dont Alternaria alternata. A l’inverse, il a été montré que la co-inoculation de siliques avec A. alternata affectait la capacité de transmission aux semences d’A. brassicicola (résultats non publiés). L’objectif de ce travail est de poursuivre l’étude des interactions entre A. brassicicola et des isolats fongiques issus de semences de radis obtenus lors du projet MetaSEED, dans le but, à terme, d’identifier un ou des isolats utilisables pour développer une méthode de bio-contrôle.
Alternaria brassicicola, agent du black spot des Brassicacées: Alternaria brassicicola est un ascomycète nécrotrophe pathogène très dommageable pour les Brassicacées comme l’arabette (Arabidopsis thaliana), la moutarde brune (Brassica juncea) ou le radis (Raphanus sativus). Il est en effet l’un des agents responsables de la maladie des taches noires (black spot) qui entraîne d’importantes pertes de rendements dans les cultures. Alternaria brassicicola a la capacité de se disséminer par contact avec les tissus atteints, mais il peut aussi infecter les graines via les siliques (Pochon et al., 2012). Au niveau de la semence, les conidies peuvent se loger dans des creux et des aspéritésà la surface des téguments, et sont protégées des conditions environnementales peu favorables, mais le mycélium peut pénétrer dans les téguments, pouvant atteindre l’embryon dans de rares cas (Guillemette, 2003; Pochon et al., 2012).
Méthodes de lutte biologique: Les méthodes dites de bio-contrôle, permettent de réduire l’impact sur l’environnement de la lutte contre les maladies des plantes, que ce soit en terme de diminution de la biodiversité ou de pollution. Le bio-contrôle peut se faire par l’application de stimulateurs de défenses des plantes (SPD) ou par l’utilisation d’agents de bio-contrôle (BCA : Biological Control Agent). Ces derniers peuvent être des insectes prédateurs de ravageurs ou des micro-organismes ayant un effet limitant sur la croissance des pathogènes. Les mécanismes de biocontrôle sont classés par catégories : compétition, parasitisme ou prédation et antibiose (Di Pietro, 1994; Card et al., 2015).
Transmission verticale des champignons phytopathogènes: Pour la majorité des espèces fongiques pathogènes des plantes, la dispersion se fait de manière strictement horizontale, que ce soit par contact direct par dispersion anémophile ou par splashing. Mais dans certains cas, la transmission est également verticale : du parent à la descendance via la semence (Fine, 1975). Cette dernière présente un impact important sur l’occurrence de la maladie dans le sens où la transmission est beaucoup moins impactée par les conditions environnementales (conditions météorologiques, passages d’animaux, …) que la transmission horizontale (Oliver et al., 2001). La transmission à la semence se fait selon trois modalités, par les fleurs, de manière systémique ou alors par voie externe (par contact du fruit avec l’agent pathogène) (Rezki et al., 2016).
Problématique et objectifs:
L’objectif de ce stage est de déterminer si certains isolats fongiques issues du microbiote de semences de radis sont capables de limiter le développement d’Alternaria brassicicola. Dans un premier temps, l’identification de 2 isolats récemment obtenus a été réalisée par voie moléculaire. Ensuite, des confrontations sur milieux solides entre les différents isolats et A. brassicicola ont été effectuées et l’inhibition de la croissance d’A. brassicicola ont été observés. Afin de déterminer si la capacité d’inhibition est liée à la production et la diffusion de composés solubles, l’action des filtrats de cultures des isolats fongiques sur la capacité de croissance d’A. brassicicola en milieu liquide a été déterminée. Enfin, la capacité de deux isolats d’A. alternata à limiter la transmission d’A. brassicicola à la semence a été testée par co-inoculation de siliques d’Arabidopsis thaliana et l’analyse microbiologique des graines.
Résultats:
Interactions fongiques:
Tests de confrontation sur milieu solide:
La mesure de la croissance d’Abra43 a été faite trois semaines après le dépôt des explants de champignons sur milieu PDA (figure 5). L’isolat Epicoccum sp. ABAI015 présente une forte capacité d’inhibition de la croissance d’A. brassicicola avec 48% d’inhibition. D’autres isolats inhibent modérément la croissance d’Alternaria brassicicola : Fusarium graminearum ABAI065 (19%), Epicoccum sp. AI035 (14%), ainsi que les isolats d’A. alternata C050 (13%), C051 (13%) et NB42 (11%). Cladosporium sp ABAI028 et Alternaria alternata C004 n’ont pas d’effet sur la croissance d’Abra43 (respectivement -2 et 2% d’inhibition de la croissance). Toutefois, il convient de nuancer ces résultats, dans la mesure où, à l’exception des confrontations avec Epicoccum sp. ABAI015 et Fusarium graminearum ABAI065, les colonies ne s’étaient pas suffisamment développées à la date où la mesure a été réalisée, pour pouvoir déterminer de façon fiable si un isolat a un pouvoir inhibiteur ou pas.
Test d’inhibition de la croissance d’A. brassicicola par des filtrats de cultures fongiques:
Les filtrats de culture ont un effet globalement faible sur la croissance d’Abra43 en milieu liquide : 15% d’inhibition au maximum (figure 6). Les filtrats de culture qui ont le plus fort effet inhibiteur sur la croissance d’Abra43 sont A. alternata C051 (15%) et C050 (12%), puis Fusarium graminearum ABAI065 (11%), Epicoccum sp. AI035 et ABAI015 (9% et 8% respectivement). Cladosporium sp. ABAI028 n’inhibe la croissance d’Abra43 que de 4%, et Alternaria alternata NB42 n’a aucun effet. En revanche, Alternaria alternata C004 stimule la croissance d’Abra43 de 20%.
Discussion:
Identification moléculaire des isolats fongiques:
L’identification des champignons est, depuis la mise au point de la PCR, largement basée sur l’utilisation de marqueurs moléculaires. L’utilisation des séquences ITS fait consensus dans la communauté des mycologues en tant qu’outil d’identification primaire. Mais l’identification des champignons sur la base de la séquence de l’ITS peut ne pas être complètement satisfaisante car les séquences ITS déposées dans les bases de données peuvent être incomplètes ou erronées. C’est pourquoi, à l’issue d’une identification primaire sur la base de la séquence ITS, une identification plus précise nécessite d’utiliser des marqueurs plus spécifiques d’un genre (Prakash et al., 2017; Bessadat et al., 2017). Dans le cas présent, les 2 isolats C050 et C051, dont l’identité était inconnue avant le démarrage de ce travail, ont été identifiés sur la base de la séquence ITS comme appartenant au genre Alternaria et à l’espèce alternata. L’utilisation de marqueurs plus spécifiques aux champignons du genre Alternaria, GPD (glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase) et EF1α (facteur d’élongation 1α) (Bessadat et al., 2017), a confirmé l’appartenance à l’espèce Alternaria alternata de C050 et C051, de même que pour l’isolat C004 (identifié antérieurement à ce travail en tant qu’ Alternaria alternata sur la base de la séquence ITS). L’isolement de champignons appartenant à l’espèce Alternaria alternata à partir de semences de radis est cohérent avec le fait qu’A. alternata est une espèce ubiquiste, fréquemment isolée à partir d’une grande variété de plantes (Bessadat et al., 2017), qui a un mode de vie essentiellement saprophyte (Lawrence et al., 2008).
Interactions fongiques in vitro:
La durée de ce stage n’ayant pas permis de réaliser de répétitions des expérimentations de confrontation sur milieu solide et de test d’activité des filtrats de culture sur la croissance d’A. brassicicola, les résultats doivent donc être considérés avec précaution. L’ensemble de ces expérimentations devra être réitéré 2 fois afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques.
Interactions fongiques in planta:
La capacité d’A. alternata à limiter la transmission d’A. brassicicola à la semence a été testée par une co-inoculation de Abra43 avec chacun des deux isolats A. alternata NB42 et C004. Comme pour les autres expérimentations réalisées dans ce travail, il sera nécessaire de faire 2 répétitions biologiques pour confirmer les résultats obtenus, mais ceux-ci sont déjà relativement robustes, dans la mesure où chaque échantillon contenait 3 plantes, ce qui a permis de réaliser une analyse statistique.
Conclusions et perspectives:
L’objectif principal de ce stage était d’étudier la capacité d’isolats fongiques issus du microbiote de semences de radis à inhiber le développement d’A. brassicicola, ainsi que sa capacité à se transmettre aux semences d’A. thaliana. L’identification moléculaire à l’aide de plusieurs marqueurs, réalisée sur 3 isolats, devra être étendue à l’ensemble des isolats étudiés ici, et, plus généralement à un panel plus larges d’isolats obtenus dans le cadre du projet MetaSEED, pour les identifier de façon plus fiable et plus précise.
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Table des matières
Introduction
Structure d’accueil
Contexte scientifique
Alternaria brassicicola, agent du black spot des Brassicacées
Méthodes de lutte biologique
Mécanismes d’action des agents de bio-contrôle
Potentiel d’application de la lutte biologique en culture
Transmission verticale des champignons phytopathogènes
Problématique et objectifs
Matériel et Méthodes
Matériel biologique
Identification moléculaire d’isolats fongiques
Extraction d’ADN à partir d’isolats fongiques
Amplification de l’ADN pour l’indentification des isolats fongiques
Révélation des produits de PCR
Analyse des séquences
Tests de confrontation sur milieu solide
Test d’inhibition de la croissance d’A. brassicicola par des filtrats de cultures fongiques
Test de la capacité d’A. alternata à limiter la capacité de transmission d’A. brassicicola à la semence d’A. thaliana
Résultats
Identification moléculaire d’isolats fongiques
Interactions fongiques
Tests de confrontation sur milieu solide
Test d’inhibition de la croissance d’A. brassicicola par des filtrats de cultures fongiques
Test de la capacité d’A. alternata à limiter la capacité de transmission d’A. brassicicola à la semenced’A. thaliana
Discussion
Identification moléculaire des isolats fongiques
Interactions fongiques in vitro
Interactions fongiques in planta
Conclusions et perspectives .
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